中华人民共和国国家标准
GB/T23788-2009
Determination of soybean isoflavone in health-care foodHigh-performance liquid chromatography
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A为资料性附录.
本标准由全国特殊膳食标准化技术委员会提出并归口，
本标准起草单位：北京市朝阳区产品质量监督检验所、红牛维他命饮料有限公司、中国食品发酵工业研究院.
本标准主要起草人：崔岩、邢晓慧、张立刚、钟其顶、张淑玲、郎涛、苏文英、吴镇君、仇凯.
保健食品中大豆异黄酮的测定方法 高效液相色谱法
1范围
本标准规定了保健食品中大豆异黄酮的测定方法.
本标准适用于以大豆异黄酮为主要功能性成分的保健食品（片剂、胶囊、口服液、饮料），也可用于保健食品原料中大豆异黄酮含量的测定.
的检出限均为5mg/kg：液体样品的大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素和染料木素组分的 本标准的检出限：固体、半固体样品大豆昔、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素和染料木素组分检出限均为0.2mg/L.
2规范性引用文件
的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准.
3. 1
大豆异黄酮soybeanisoflavone
大豆昔、大豆黄昔、染料木苷、大豆素、大豆黄素和染料木素的总称，黄酮类物质.分子式如下：大豆苷：CHO，大豆黄苷：CHO染料木苷CHO，大豆素：CHO，大豆黄素：CHO，染料本素：CHO
4方法提要
样品制备、提取、过滤后，经高效液相色谱仪分析（C柱分离），依据保留时间定性，用外标法定量.
5试剂和材料
本标准使用符合GB/T6682规定的一级水.除另有规定仅使用分析纯试剂.
5.1乙睛：色谱纯.5.2甲醇：优级纯.5.380%甲醇：用甲醇80mL，加水20mL，混匀.5.4磷酸.5.6二甲基亚：色谱纯. 5.5磷酸水溶液：用磷酸调节pH至3.0，经0.45μm滤膜过滤.5.750%二甲基亚润溶液：取二甲基亚荻50mL，加水50mL混匀.5.8大豆异黄酮标准贮备溶液：称取大豆苷（daidzin）、大豆黄昔（glycitin）和染料木苷（genistin）、大豆
素（daidzein）、大豆黄素（glycitein）和染料木素（genistein）（纯度均为98.0%以上）各4mg，分别置于10mL容量瓶中，加入二甲基亚（5.6）至接近刻度，超声处理30min，再用二甲基亚祺（5.6）定容.各标准贮备溶液浓度均为400mg/L（大豆苷、大豆黄昔、染料木苷、大豆素、大豆黄素和染料木素）.
5.9大豆异黄酮混合标准使用溶液：
8.0mg/L混合标准溶液配制：吸取大豆苷、大豆黄昔、染料木昔、大豆素、大豆黄素、染料木素六种标准贮备溶液（5.8）各0.2mL于10mL容量瓶中.加人等体积水、用50%二甲基亚矾溶液（5.7）定容.
16.0mg/L混合标准溶液配制：吸取大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素、染料木素六种标准贮备溶液（5.8）各0.4mL于10mL容量瓶中，加人等体积水，用50%二甲基亚溶液（5.7）定容.
24.0mg/L混合标准溶液配制：吸取大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素、染料木素六种标准贮备溶液（5.8）各0.6mL于10mL容量瓶中，加人等体积水，用50%二甲基亚溶液（5.7）定容.
32.0mg/L混合标准溶液配制：吸取大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素、染料木素六种标准贮备溶液（5.8）各0.8mL于10mL容量瓶中，加人等体积水，用50%二甲基亚溶液（5.7）定容.
40.0mg/L混合标准溶液配制：吸取大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素、染料木素六种标准贮备溶液（5.8）各1.0mL于10mL容量瓶中，加人等体积水，用50%二甲基亚溶液（5.7）定容.
6仪器和设备
6.1高效液相色谱仪：带紫外检测器（或二极管阵列检测器）.6.3分析天平：感量0.01mg. 6.2超声波振荡器.6.4酸度计：精度0.02pH.6.5离心机：转速不低于8000r/min.6.6滤膜：孔径为0.45gm6.7容量瓶：10mL.
7分析步骤
7.1样品处理
7.1.1固体样品、半固体样品：固体样品粉碎、磨细（过80目筛）、混匀，半固体样品混匀，称取样品0.05g~0.5g（精确至0.1mg），用80%甲醇溶液（5.3）溶解并转移至50mL容量瓶中，加人80%甲醇7.1.2液体样品：吸取混匀的液体样品0.5mL~5.0mL于50mL容量瓶中，加人80%甲醇溶液至接 溶液至接近刻度.近刻度.7.1.3将上述样品溶液（7.1.1或7.1.2）用超声波振荡器振荡20min，用80%甲醇定容，摇匀.取样品溶液置于离心管中，离心机离心15min（转速大于8000r/min）.取上清液用滤膜（6.6）过滤，收集滤液备用.
7.2色谱条件
7.2.1色谱柱C-4.6mm×250mm，粒度5pm不锈钢色谱柱：也可使用分离效果相当的其他不锈钢柱.
7.2.2流动相流动相A：乙晴（5.1)
流动相B：磷酸水溶液（pH=3.0)（5.5）.
7.2.3梯度洗脱条件见表1.
表1
时间/in 0 10 23 08 09 55 56 60流动相A/% 12 18 24 30 30 80 12 12流动相 B/% 88 82 76 70 70 20 88 ss
7.3测定
7.3.1定性
分别将大豆苷、大豆黄苷、染料木昔、大豆素、大豆黄素、染料木素的标准贮备溶液（5.8）稀释10倍后，按色谱条件（7.2）进行测定，依据单一标准样品的保留时间，对样品溶液中的组分进行定性，定性色谱图参见附录A
7.3.2定量
将大豆异黄酮混合标准使用溶液（5.9）在色谱条件（7.2）下进行测定，绘制以峰面积为纵坐标、混合溶液中大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素和染料木素的响应值均在工作曲线的线性范围 标准使用溶液浓度为横坐标的标准曲线.将7.1.3制备的样品溶液注人高效液相色谱仪中，保证样品内，由标准曲线查得样品溶液中大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素和染料木素的浓度.
8结果计算
8.1样品中大豆异黄酮各组分[大豆苷（X）、大豆黄苷（X）、染料木苷（X）、大豆素（X）、大豆黄素（X;）和染料木素（X）的含量分别按式（1）计算：
式中：
X一一样品中大豆异黄酮单一组分的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）或毫克每升（mg/L）；“根据标准曲线得出的大豆苷（或大豆黄苷、染料木甘、大豆素、大豆黄素、染料本素）的浓度， 单位为毫克每升（mg/L）；V样品稀释液总体积的数值，单位为毫升（mL）：一固体、半固体样品质量的数值，单位为克（g）；液体样品体积的数值，单位为毫升（mL）.
8.2样品中大豆异黄酮总含量，按式（2）计算：
式中：
X-样品中大豆苷的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）或毫克每升（mg/L）； X--样品中大豆异黄酮总含量，单位为毫克每千克（mg/kg）或毫克每升（mg/L）；X-样品中大豆黄苷的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）或毫克每升（mg/L)；X样品中染料木苷的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）或毫克每升（mg/L）；X-样品中大豆黄素的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）或毫克每升（mg/L）； X -- 样品中大豆素的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）或毫克每升（mg/L）；X样品中染料木素的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）或毫克每升（mg/L）.计算结果应表示到小数点后一位.
9精密度
在重复性条件下，两次独立测定结果之差不得超过算术平均值的10%.
