中华人民共和国国家标准
GB/T25877-2010
Starch gel electrophoresis isozyme analysis
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B、附录C、附录D和附录E均为规范性附录.本标准由全国水产标准化技术委员会归口. 本标准由中华人民共和国农业部提出.本标准起草单位：中国海洋大学、黄海水产研究所.本标准主要起草人：高天翔、张岩、韩志强、肖永双、张解.
淀粉胶电泳同工酶分析
1范围
本标准规定了淀粉胶电泳同工酶分析的试剂和材料、仪器、抽样、分析步骤及结果判定.本标准适用于常见淡、海水水生生物的水平凝胶电泳常见的同工酶分析.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款，凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括期误的内容）或修改版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T18654.1-2008养殖鱼类种质检验第1部分：检验规则GB/T18654.2-2008养殖鱼类种质检验第2部分：抽样方法
3原理
利用同工酶所带电荷的不同与分子大小的不同，在电场作用下，凝胶中出现的同工酶迁移率不同，经催化、染色、扫描获得各同工酶谱带、数目及吸收强度等经比较分析，判定鱼类的遗传特性.
4试剂和材料
除另有说明外，试剂均为分析纯或以上级别，水为蒸馏水或去离子水或相当纯度的水.
4.1水解马铃薯淀粉.4.2柠檬酸.4.3乳酸.4.4乙二胺四乙酸.4.6苹果酸. 4.5乙二胺四乙酸二钠.4.7乳酸锂.4.8磷酸氢二钠.4.9磷酸二氢钠. 4.10辅酶I.4.11辅酶IⅡ.4.12分嗪甲酯硫酸盐.4.14异柠檬酸三钠， 4.13氯化硝基四氮唑蓝.4.156-磷酸葡萄糖酸钠.4.16乙醇.4.17丙酮.4.18a蔡乙酸，4.19a-磷酸甘油. 4.206-磷酸葡萄糖.4.21山梨糖醇.
5仪器
6抽样
4.22固蓝RR盐.4.24盐酸. 4.23冰乙酸.4.25氢氧化钠.4.26肝素.4.27氯化镁.4.283-氨甲基-吗啡啉.4.29TC-7.0制胶缓冲液：配制方法见附录A. 4.30TC-8.0制胶缓冲液：配制方法见附录A.4.31CAPM-6.0制胶缓冲液：配制方法见附录A.4.32CAPM-7.0制胶缓冲液：配制方法见附录A4.33TC-7.0电泳缓冲液：配制方法见附录B 4.34TC-8.0电泳缓冲液：配制方法见附录B.4.35CAPM-6.0电泳缓冲液：配制方法见附录B.4.36CAPM-7.0电泳缓冲液：配制方法见附录B4.37淀粉凝胶：配制方法见附录C.4.38染色缓冲液：配制方法见附录D. 4.39染色液：几种常见同工酶染色液配制方法见附录E.
5.1微量匀浆机.5.2高速冷冻离心机（转速12000r/min）. 5.3多用电泳仪.5.4真空抽气机（泵）.5.5电炉或微波炉，5.7多层滤纸. 5.6割胶器.5.8激光扫描仪.5.9pH计：精度为0.01.5.10制胶模具.5.124℃冷藏冰箱. 5.11染色盒.5.13低温冰箱：冰室温度在一20C以下.5.14恒温培养箱.5.15分析天平：精度为0.0001g. 5.16电子天平：精度为0.1g.5.17摄影装置：数码照相机.
6.1样品的抽样
按GB/T18654.2-2008的规定执行.
6.2取样取样品组织1g~2g试样，于低温冰箱中（-25C以下）保存；对于血液试样，加肝素抗凝，于4℃C2
冰箱中保存，备用.
7分析步骤
7.1分析样品的制备
电泳前取0.3g左右样品放人1.5mL离心管，加入等体积的蒸馏水或提取液后置于冰浴中研磨，研磨混合液置于冷冻离心机中，在4℃、12000r/min的条件下离心直至上清液澄清，取上清液冷冻保存备电泳用：
对于血液试样，待分离出血清后上样.
7.2凝胶制备
凝胶制备见附录C.
7.3电泳步骤
用手术刀在凝胶距离边缘三分之一（约2.5cm）处切开，用适当大小的滤纸片取7.1制备的样品泳缓冲液，用滤纸搭盐桥，在4C条件下以恒定电流（40mA）进行电泳，电泳时间依酶的种类面不同. 提取液（或直接用适当大小的滤纸片蘸取冷冻肌肉肉汁）插入切口中.上样完毕后，向电泳槽内加入电
7.4染色、固定
电泳结束后，用割胶弓将凝胶水平切割为1.3mm厚的薄片，置于染色盒中，将配制好的染色液倒人染色盒后置于37C的恒湿箱中进行染色.待显色充分后，用7%的冰乙酸溶液终止反应.
各种酶的染色液配制方法见附录D和附录E.
7.5制干胶片
取染色后的凝胶放于大小合适的玻璃纸上，压制封膜，风干后编号保存.
7.6摄影、扫描
用照相近视镜头对凝胶及其谱带照相，或用激光扫描仪对风干片电泳谱带进行扫描.
7.7结果分析
7.7.1酶位点与等位基因分析
根据酶的结构组成和同工酶在组织中所表现的酶谱特征，确定每种同工酶的编码基因位点、多态位点的等位基因類率.
7.7.2群体遗传特异性
多态位点比例（P）、平均杂合度观察值（H.）、平均杂合度期望值（H）分别按式（1）、式（2）和式（3）计算：
式中：
P多态位点比例：
N-多态位点数：
检测位点总数.
式中：
H平均杂合度观察值；
m第1个位点上的等位基因总数：
n检测位点总数.
