中华人民共和国国家标准
GB/T25879-2010
Determination of lysozyme in chicken egg whiteSpectrophotometry
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准由中华人民共和国农业部提出.本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口. 本标准起草单位：扬州大学动物科学与技术学院.本标准主要起草人：王金玉、谢恺舟、戴国俊、侯启瑞、刘大林.
鸡蛋蛋清中溶菌酶的测定 分光光度法
1范围
本标准规定了鸡蛋蛋清中溶菌酶的分光光度测定方法.本标准适用于鸡蛋蛋清中溶菌酶含量和活力的测定.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准.
3. 1
蛋清eggwhite
位于鸡蛋蛋壳内膜和蛋黄膜之间的半流动胶体物质.
3. 2
azos界
一种专门作用于微生物细胞壁的糖苷水解酶.
4鸡蛋蛋清中溶菌酶含量的测定
4.1原理
溶菌酶在281nm波长处有最大吸收峰，溶菌酶标准品用每升溶液含9g氯化钠的溶液溶解并稀释成不同梯度浓度，在281nm波长处测定吸光度并绘制标准曲线，求出标准曲线回归方程.试样经过处理，按溶菌酶标准品测定方法，测定试样中的吸光度，根据其吸光度值由标准曲线回归方程计算试样 中溶菌酶含量.
4.2仪器
4.2.1紫外-可见分光光度计（波长范围190nm~900nm，波长确定性土0.3nm，波长重复精度土0.1nm）.4.2.2电子分析天平（感量0.1mg、1mg）.4.2.3离心机（最大离心力2325g具10ml离心管）.
4.3试剂与材料
4.3.1溶菌酶标准品，优级纯，活力在20000U/mg左右.4.3.2氯化钠，分析纯.4.3.3蒸馏水按GB/T6682执行. 4.3.4医用脱脂纱布.
4.4试剂配制
4.4.10.9%氯化钠溶液：称取氯化钠（4.3.2）0.9g，溶解于蒸馏水中，定容至100ml.
4.4.2溶菌酶标准工作液：称取溶菌酶标准品（4.3.1)0.500g，以0.9%氯化钠溶液（4.4.1）溶解定容至1000mL，得到500μg/mL的溶菌酶标准工作液，于4C密封保存备用，1周内使用.
4.5分析步骤
4.5.1标准曲线的绘制
分别吸取溶菌酶标准工作液（4.4.2）1mL、2mL、3mL、4mL、5mL于25mL容量瓶中.以0.9%氯化钠溶液（4.4.1）稀释至刻度，混匀.用10mm石英比色Ⅲ比色，以0.9%氯化钠溶液（4.4.1）为参比溶液，在波长281nm处依次测定各标准工作液的吸光度，以溶菌酶标准工作液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，并求出标准曲线回归方程.
4.5.2试样测定
鸡蛋蛋清用4层纱布过滤，取过滤试样1mL.用0.9%氯化钠溶液稀释定容至100mL，混匀，避免起泡沫.吸取5mL蛋清的氯化钠溶液，1310g离心5min，取上清液，按照绘制标准曲线的操作步骤（4.5.1），在波长281nm处测定试样溶液的吸光度.平行测定三次，取结果的算术平均值，由标准曲线回归方程计算试样溶液中溶菌酶的浓度.
4.6结果的计算与表述
根据试样溶液吸光度值，用标准曲线回归方程计算试样溶液中溶菌酶的浓度r.鸡蛋蛋清中溶菌酶的含量按式（1)计算：
式中：
X-鸡蛋蛋清中溶菌酶的含量，单位为微克每毫升（μg/mL）：（试样溶液中溶菌酶的浓度，单位为微克每毫升（pg/mL)：V-试样溶液定容的体积，单位为毫升（mL）：
V试样的体积，单位为毫升（mL）.
4.7精密度、准确度、灵敏度
4.7.1精密度
本方法检测鸡蛋蛋清中溶菌酶含量的批内变异系数CV≤3%，批间变异系数CV≤5%.
4.7.2准确度
鸡蛋蛋清溶液中添加溶菌酶标准品浓度在20μg/mL~60μg/mL范围内，回收率≥95%.
4.7.3灵敏度
本方法检测鸡蛋蛋清落液中溶菌酶含量的最低检测限为0.3pg/mL
5鸡蛋蛋清中溶菌酶活力的测定
5.1原理
为在特定条件下单位时间内转化底物的速度.本标准根据该原理，以溶壁微球菌为底物，用分光光度 溶菌酶通过溶解G菌的细胞壁使细菌溶解，菌液在可见光范围内的吸光度降低.酶的活力表示法，以450nm波长处菌液单位时间内吸光度降低程度为依据，测定溶菌酶的活力.
5.2仪器
5.2.1紫外-可见分光光度计（波长范围190nm~900nm.波长确定性土0.3nm，波长重复精度土0.1nm）.5.2.2电子分析天平（感量0.1mg、1mg）. 5.2.3摇床（控湿范围0℃~100℃C，转速振幅：0r/min~300r/min）.5.2.4pH计（精密度士0.01）.5.2.5离心机（最大离心力2325g，具10mL离心管）.
5.2.6高压灭菌锅.5.2.7超低温冰箱.5.3.1氯化钠，分析纯. 5.3试剂与材料5.3.2甘油（丙三醇），分析纯.5.3.3磷酸氢二钠，分析纯.5.3.4磷酸二氢钠，分析纯.5.3.5牛肉膏，生化试剂.5.3.6蛋白陈，生化试剂. 5.3.7酵母提取物，生化试剂.5.3.8琼脂，生化试剂.5.3.9溶壁微球菌（Micrococcax ysodeikticas Fleming）
5.4试剂配制与培养基制备
5.4.10.9%氯化钠溶液：称取氯化钠0.9g，溶解于蒸馏水中，定容至100mL，121C高压灭菌30 min. 5.4.220%甘油（丙三醇）溶液：称取甘油20.0g，溶解于蒸馏水中，定容至100mL，121C高压灭菌30 min.5.4.30.2mol/LpH6.2磷酸盐缓冲液：称取磷酸氢二钠（Na:HPO12H;O）71.63g，用蒸馏水溶解定容至1000mL:称取磷酸二氢钠（NaHPO2HO)33.00g，蒸馏水溶解并定容至1000mL，取5.4.4固体培养基：牛肉膏0.3g、蛋白陈1.0g、氯化钠0.5g溶解于100mL水中，各组分溶解后，加 NaHPO溶液18.5mL与 NaHPO.溶液81.5mL.混合，混匀即可.人琼脂2.0g，持续搅择至琼脂完全溶解.用1mol/L氢氧化钠调整pH至7.2~7.4，并用水定容至100mL，分装在试管里，每管液量为15mL~20mL，加棉花塞，121C高压灭菌30min后，倒人培养Ⅲ中加盖，冷却至室温.5.4.5液体LB培养基：蛋白陈1.0g、酵母提取物0.5g、氯化钠1.0g溶解于100mL水中，用1mol/L
氢氧化钠调整pH至7.2~7.4，分装在试管里，121C高压蒸汽灭菌30min.
5.5分析步骤
5.5.1菌液的制备
将溶壁微球菌（5.3.9）先接种于灭菌的固体培养基（5.4.4）中活化和扩大培养，再接种于灭菌的液体LB培养基（5.4.5）中，37C摇床培养至菌体增殖，培养9h~10h，将培养液1310g离心10min收集沉淀的菌体.该菌体加人3倍体积灭菌的0.9%氯化钠溶液（5.4.1）悬浮，1310g离心10min，收集 沉淀的菌体，重复4次～5次，再用20%甘油溶液（5.4.2）将菌体制成黏稠状，置于一60C保存，半年内使用.
使用前，用磷酸盐缓冲液（5.4.3）溶解溶壁微球菌，调至OD吸光度值范围在1.2~1.4.2℃~8℃放置.
5.5.2鸡蛋蛋清溶液的制备
心5min除去不溶物. 鸡蛋蛋清用4层纱布过滤，取过滤试样1mL，用磷酸盐缓冲液（5.4.3）定容至100mL，1310g离
5.5.3试样测定
按4.5的方法，在281nm波长处测定鸡蛋蛋清溶液的吸光度，并计算蛋清溶液中的溶菌酶浓度c.鸡蛋蛋清溶液、菌液于25C水浴中保温，在450nm波长处测定酶活力，试样测定反应体系见表1.
