T/SDYY265-2026
五叶草莓脱毒组培快繁技术规程
Code of practice fortissue culture and rapid propagation forvirus-freeFragariapentaphylla Losinsk.
山东园艺学会 发布
T/SDYY265-2026
前言
本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由山东园艺学会提出并归口.
本文件起草单位：青岛农业大学、尚好科技有限公司、山东省农业科学院、青岛市农业技术推广中心、青岛市农业科学研究院、成县连丰农产品有限责任公司、青岛华垦进出口有限公司、北京大学现代农业研究院.
本文件主要起草人：郑晓东、王彩虹、郁东兴、王俊峰、刘爱娜、李少旋、于连泽、鲍雯青、田义辑、赵强、孙志娟、王婵玉、刘萍、张庶、陈立勇、张蕊芬、周军会、梁咏琪、张瑶、孙泽春.
五叶草莓脱毒组培快繁技术规程
1范围
本文件界定了五叶草莓组培快繁的术语与定义，规定了外植体构建、初代培养、继代培养、生根培养、病毒检测等技术要求.
本文件适用于五叶草莓组培苗繁育.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB8599-2023大型压力蒸汽灭菌器技术要求
DB13/T5110-2019植物组织培养室组建及操作技术规程
3术语与定义
下列术语和定义适用于本文件.
3. 1
五叶草莓Fragaria pentaphylla Losinsk
蔷薇科草莓属，二倍体植物.叶片呈羽状五小叶，质地较厚，小叶片倒卵形或椭圆形.聚伞花序，白色花瓣，果实呈白色或红色卵圆形，平均单果重为0.8g-1.5g，表面密布棕红色斑点，其种子均凹于果面.
3.2
脱毒Virus elimination
利用组织培养，去除感染病毒的草莓植株体内所携带的病毒，从而获得无病毒种苗的过程.
3. 3
外植体 Explant
植物组织培养中作为离体培养材料的器官或组织片段.
4外植体构建
4.1外植体选取
选取健壮无病虫害的草莓植株，剪取当年生匍甸茎.以4月、5月、10月、11月晴天上午取材为宜.
4.2外植体预处理
剪取能甸茎顶端2cm~3cm，去除叶片和叶柄，用自来水流水冲洗1h，沥干备用.
4.3外植体消毒
4.3.1前期准备
用75%酒精擦拭超净工作台台面，清除灰尘和杂物，紫外灯照射灭菌30min~60min，之后通风10min.锻子、刀片、三角瓶等工具高温高压灭菌锅121C灭菌25min，冷却后备用.
4.3.2快速灭菌
T/SDYY 265-2026
在超净工作台中将预处理后的甸茎放入无菌三角瓶，倒入75%乙醇，浸泡30s，期间轻轻摇晃三角瓶.然后倒出乙醇，立即用无菌水冲洗外植体3次，每次1min~2min.
4.3.3深层灭菌
在三角瓶中倒入适量有效氯含量为1%的NaClO溶液，溶液应没过外植体，浸泡5min~6min，期间轻轻摇晃三角瓶.然后倒出消毒剂，用无菌水冲洗外植体5次，每次2min~3min，期间轻轻摇晃三角瓶，减少消毒剂残留.
5初代培养
5.1激素的母液配制
将所需的6-苄氨基嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA）、吲哚丁酸（Indole-3-butyric Acid，IBA）用1mol/LNaOH溶解，再用蒸馏水稀释后分别配制成0.1mg/mL的母液，装入棕色广口瓶中，置于4°C冰箱保存.
5.2初代培养基制备
热搅拌至完全溶解.溶解后加入0.5mg/L6-BA和0.1mg/LIBA，用1mol/LNaOH或1mol/LHC1调节 按所需容量的80%加蒸馏水，随后加入Murashige&Skoog培养基（M519干粉）、3%蔗糖，稍加pH至5.8~6.0.随后加入0.7%琼脂并充分搅拌，高温高压灭菌锅121C灭菌25min后分装备用，灭菌锅使用符合GB8599-2023要求.
5.3茎尖接种
生长点朝上接种在初代培养基上，一瓶接种3个～4个生长点为宜. 在解剖镜下，用锻子逐层剥去小叶，直至露出半球形的生长点，用刀片切取0.2mm~0.5mm茎尖，
5.4接种后管理
接种后，将培养瓶置于培养室培养，温度20℃～23°℃，光照强度2000lx，日均光照时长12h/d，培养室环境符合DB13/T5110-2019要求.
6继代培养
6.1继代芽体选择
从初代接种日起算，培养30d~40d后，茎尖分化出不定芽，形成2cm~3cm高的丛生芽时可进行继代增殖.
6.2继代培养基制备
按所需容量的80%加蒸馏水，随后加入M519干粉、3%蔗糖，稍加热搅拌至完全溶解.溶解后加入6-BA母液至终浓度0.5mg/L和IBA母液至终浓度0.03mg/L，用1mol/LNaOH或1mol/LHC1调节pH至 5.8~6.0.随后加入0.7%琼脂并充分搅拌，高温高压灭菌锅121℃灭菌25min后分装备用.
6.3继代苗接种
用无菌手术刀将单株苗从基部切下，去除愈伤，保证切口平整，避免撕裂，并将单株苗转接至继代培养基中.需注意的是，继代次数不宜超过7次，总培养时长不超过1年，以防止组培苗发生变异.
6.4接种后管理
接种后将组培苗置于光照强度2000Ix、日均光照时长12h、温度24℃～26℃、湿度60%~70%的培养室中培养.
7生根培养
7.1生根培养基制备
按所需容量的80%加蒸馏水，随后加入M519干粉、3%蔗糖，稍加热搅拌至完全溶解.溶解后加入0.3mg/LIBA，用1mol/LNaOH或1mol/LHC1调节pH至5.8~6.0.完全溶解后加入0.7%琼脂并充分搅拌，高温高压灭菌锅121C灭菌25min后分装备用.
7.2生根苗的选取与处理
小苗、黄化苗和玻璃化苗.用无菌手术刀将单株苗从基部切下，保证切口平整，避免撕裂茎秆，若基部 从继代培养苗中，挑选健壮、无畸形、高度2.5cm~3cm、带2片~3片展叶的单株苗，避免选用弱带有愈伤组织，需切除多余愈伤.
7.3接种后管理
接种后将组培苗置于光照强度3000lx、日均光照时长14h、温度24℃~26℃、湿度60%~70%的组培室中培养.从接种日起算，当生根至第35d~45d时，根系健壮、有分支，根数3条以上时，苗高2.5cm~ 3cm、带2片～3片展叶时可进行驯化，别化前需提前5d～7d开盖炼苗，逐步降低湿度，提高移裁成活率.
8病毒检测
8.1检测方法
转录一聚合酶链式反应）检测. 在组培苗生根培养化前进行病毒检测，每批次组培苗随机抽取5%～10%的样本，采用RT-PCR（逆
8.2检测步骤
8.2.1RNA提取
在超净工作台上切取五叶草莓组培苗叶片0.1g~0.2g，放入无菌无酶的2ml离心管，并放入1个钢珠做好相应标记，迅速置于液氮中备用.将样品放入组织研磨机中，研磨频率70Hz，研磨时间90s.按照试剂盒步骤（山东思科捷生物技术有限公司，新型植物RNA快速提取试剂盒，货号：AC0305），提取总RNA.
8.2.2反转录
按照试剂盒步骤（山东思科捷生物技术有限公司，SPARKscriptIIRTPlusKit，货号：AC0304），得到cDNA模板，置于-20C暂存备用.
8.2.3PCR检测
用primer5.0软件设计引物序列（参见附录A），在PCR管中依次加入3μLddHzO、0.5μLPrimerF、0.5μLPrimerR、3μL2XMix、1μLcDNA并离心混匀，放入PCR仪中，扩增条件设置为94C预变性3min:94℃变性30s，52C退火30 s，72℃延伸1min，共30个循环：72℃延伸10min，置于4C冰箱保存备用.
8.2.4琼脂糖凝胶电泳
吸取5uLPCR产物及Marker点入琼脂糖胶孔中，120V恒压条件下电泳20min.电泳完成后，通过凝胶成像系统观察目的片段，确认为无病毒，可进行驯化.
