T/SAASS 体 标 准
T/SAASS 332-2026
Technical code of practice for establishing gene editing system in pea
山东农学会 发布
前言
起草. 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由山东省农业科学院提出.
本文件由山东农学会归口.
本文件起草单位：山东省农业科学院、盐碱地综合利用技术创新中心.本规程起草人：李冠、李娜娜、贾凯华、杨永义、李润芳、田汝美、刘敏、白静、谢坤、宫永超.
豌豆基因编辑技术体系构建技术规程
1范围
理技术要求. 本文件规定了豌豆基因编辑技术体系构建的试验平台条件、体系构建准备、体系构建流程和档案管
本文件适用于采用CRISPR/Cas基因编辑技术开展豌豆基因功能研究、基因编辑育种相关研究、材料创制及技术操作.
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB19489实验室生物安全通用要求
GB/T46433.1生物技术基因组编辑第1部分：术语
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义.
4缩略语
下列缩略语适用于本文件.
A. Rhizogenes:根瘤菌（Agrobacterium rhizogenes) bp:碱基对（Base Pair）Cas9:CRISPR关联基因编码的蛋白（CRISPR associated 9）Repeats) CRISPR：成簇规律间隔短回文重复序列（Clustered Regularly Interspersed Short PalindromicU6 snRNA: 小核 RNA (small nuclear RNA)DH5a：一种大肠杆菌菌株，常用于分子克隆实验，是一种高效的DNA转化宿主. DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）E.Coli：大肠埃希氏菌（Escherichia coli）GoldenGate：一种基因组拼接技术，通过限制性内切酶和DNA连接酶高效拼接多个DNA片段. Hi-TOM：用于高通量突变检测的在线工具，主要用于基因编辑后的突变鉴定.K599：一种根瘤菌菌株，广泛用于植物转基因实验中的基因导入.NGG：PAM序列中的常见三核苷酸（N表示任何碱基，G是鸟嘌呤） ODo:600 mm波长下的光密度（OpticalDensity at 600nm）PAM：识别序列（Protospacer Adjacent Motif）PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）sgRNA scaffold：sgRNA支架结构，是CRISPR/Cas9系统中引导RNA的一个部分，帮助保持其结构 sgRNA:单链引导RNA（Single Guide RNA)功能.
tRNA:转运 RNA (Transfer RNA)
TY：胰蛋白陈和酵母提取物组成的一种培养基（Tryptone and Yeast extract），用于微生物的培养.
5基本要求
5.1实验场所
实验场所及设施应符合GB19489、GB/T27428及植物基因工程相关生物安全管理规定.
5.2仪器设备
器、恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台及高压灭菌锅.用于豌豆无菌苗和转化材料培养的设施应具备 所需仪器设备包括PCR仪、核酸电泳与凝胶成像系统、超微量分光光度计、高速离心机、涡旋振荡温度、光周期及湿度可调控功能.
6体系构建准备
6.1植物材料
选用适合进行农杆菌转化的豌豆品种或其他合适的基因型材料.
6.2菌株
E.Coli DH5a用于质粒克隆与扩增：4rhizogenesK599用于豌豆遗传转化，见附录A.1.
6.3载体
包含Cas9表达单元及sgRNA表达骨架的模块化载体，见附录A.2.
6.4酶与主要试剂
所需主要试剂包括分子生物学常用酶制剂、核酸纯化试剂、突变检测试剂盒、植物基因组DNA提取试剂，以及植物培养所需的培养基及相关添加剂，见附录A3、A.4和A.5.
7体系构建流程
7.1U6启动子的筛选与克隆
为候选启动子序列，并设计特异性引物对候选内源U6启动子进行克隆.采用高保真PCR扩增目标片段， 通过序列同源比对在豌豆基因组中鉴定内源U6snRNA基因，选取其转录起始位点上游600bp区域作经凝胶纯化后连接至平端克隆载体，转化DH5a，并通过抗性筛选、菌落PCR、限制性酶切及测序分析验证获得正确克隆.
7.2中间载体的构建
sgRNA表达单元，并将其克隆至含Cas9表达框的双元载体中形成sgRNA表达中间载体.通过抗性筛选、PCR 基于验证正确的内源U6启动子，采用酶切连接方法分别将U6启动子与sgRNAscaffold连接，构建扩增、限制性酶切及测序分析对载体构建的正确性进行验证.
7.3靶向载体的构建
根据目标基因序列设计满足PAM为NGG的特异性sgRNA表达盒，同时利用tRNA-sgRNA融合表达策略以提高基因编辑效率.采用Golden Gate组装方法，将sgRNA表达盒组装至sgRNA表达中间载体中，构建基 因编辑靶向载体，并将其转化至发根农杆菌K599感受态细胞中，经检测验证获得阳性转化子.
7.4瞬时遗传转化
挑选饱满干净、生长状态好的豌豆种子平铺在无菌培养皿中，将放置豌豆的培养皿放在密封状态良好的干燥器中，将300mlL次氯酸钠溶液放在500mL的小烧杯中，并将小烧杯放在干燥器内，移液枪取20
mL浓盐酸加入放有次氯酸钠溶液的烧杯中，并迅速盖好干燥器的盖子，密闭消毒10h~12h.将消毒后的豌豆种子接种于萌发培养基，在25C条件下、16h光照/8h黑暗的培养环境中培养约7d~10d获得无菌苗：发根农杆菌经活化后，于含相应抗生素的TY液体培养基中，在28C、200rpm条件下振荡培养至菌 液0D为约0.6~0.8.取无菌苗子叶节并保留约3mm~5mm下胚轴作为外植体，置于侵染液中侵染约30min.侵染后将外植体转入共培养培养基，在28℃黑暗条件下共培养约4d：共培养结束后，经含羧卡青霉素和头孢霉素的清洗液洗涤，转入毛状根诱导培养基，在28C黑暗条件下培养约3周，并每约10d更 换一次新鲜的诱导培养基，以诱导毛状根形成，见附录A.5.
7.5突变检测与分析
从毛状根材料中提取基因组DNA，针对各编辑靶位点设计特异性引物，对目标区域进行PCR扩增，扩增片段长度控制在180bp~250bp.采用Hi-T0M试剂盒对PCR产物开展高通量测序，将各样本测序数据与参考序列进行比对分析，鉴定插入和缺失等突变类型.各靶点的编辑效率按式（1）进行计算：
式中：
A-一编辑效率：B--发生编辑的有效测序序列数：C一一总有效测序序列数.
7.6基因编辑高效性判定标准
和编辑效率对基因编辑系统的效率水平进行分级判定，分级标准见表1. 基因编辑系统高效性的评价原则和方法按照GB/T46433.1的规定执行.根据目标位点的突变类型
表1编辑效率分级标准表
效率等级 编辑效率A 突变类型特征说明高效 A≥50 以插入和缺失等靶向突变为主，突变类型清晰且一致性较好中等 低效 20≤A<50 5≤A<20 可检测到明确的靶向突变，但不同转化事件间效率存在一定差异 靶向突变比例较低，突变类型分散极低效或无效 A<5 未检测到稳定的靶向突变或突变比例极低 7.7体系构建流程图 豌豆基因编辑技术体系构建流程图见图1.
