T/SAASS 体 标 准
T/SAASS339-2026
Technical code of practice for construction and evaluation of carotenoid-synthesizingmicrobial chassiscells
山东农学会 发布
前言
起草. 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由山东省农业科学院提出.
本文件由山东农学会归口.
本文件起草单位：山东省农业科学院、山东佰萃生特殊医学用途配方食品有限公司、山东百沃生物科技有限公司、山东种业智科农业服务集团有限公司.
本文件主要起草人：陈高、张樱馨、宣宁、耿耘、邵亚会、边斐、杨文龙、顾林林、刘金、赵红军、靳梦潇、王晓霞.
类胡萝下素合成微生物底盘细胞构建与评价技术规程
1范围
录流程. 本文件规定了类胡萝卜素合成微生物底盘细胞的构建流程、遗传操作要求、性能评价指标及数据记
本文件适用于利用酵母、大肠杆菌、蓝细菌和真核微藻等微生物底盘细胞进行类胡萝卜素生物合成的研究、开发与产业化应用.
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用面构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB19489实验室生物安全通用要求GB/T31520红球藻中虾青素的测定液相色谱法GB/T41133番茄制品中番茄红素、叶黄素、胡萝卜素含量的测定超高效液相色谱法 GB/T37873合成基因质量评价通则GB/T44471-2024生物技术基本术语GH/T1386果蔬食品中叶黄素、玉米黄质、隐黄质和胡萝卜素的测定 NY/T1736微生物肥料菌种鉴定技术规范SN/T2667-2010转基因微生物定性检测方法
3术语和定义
下列界定的术语和定义适用于本文件.
3.1
生物元件biologicalpart
用来组装生物系统和分子机器的具有最基本生物功能的核酸或蛋白质序列.
[来源：GB/T444712024，9.4]
3.2
宿主细胞hostcell
被选定作为生物制造平台的基础和起点、未经工程化改造的原始微生物细胞.
3.3
底盘细胞chassiscell
调控. 让设计的遗传程序在其中发挥作用的宿主细胞，具备清晰遗传背景，可通过生物元件组装进行代谢
[来源：GB/T44471-2024，9.9，有修改]
3.4
代谢流metabolicflux
在特定环境条件下物质在代谢网络有关代谢途径中按一定规律进行生物代谢、转化和流动而形成的物质流.
4宿主细胞选择
4.1基因组要求
所选宿主细胞宜具有清晰、明确的遗传背景，推荐使用已完成全基因组测序的菌株或藻株.
4.2遗传操作要求
选择宿主细胞时，应优先考虑具备成熟、可用的生物元件，能够将外源DNA高效导入细胞内，并使其以染色体整合或质粒复制的形式稳定维持的菌株或藻株.
4.3工业适用性要求
选择具有良好工业适用性的宿主细胞，具有适应性广泛、快速生长、耐受性强等特点，如：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）适用于脂溶性类胡萝卜素合成、大肠杆菌（Escherichia coli）适用 于水溶性衍生物合成、集胞藻PCC6803（Synechocystis sp.PCC 6803）和莱茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii）适用于光合驱动型合成.
5底盘细胞构建
5.1宿主细胞准备
5.1.1宿主细胞获取
购买，保证从正规渠道获取有质量保证的菌株或藻株. 查询专业基因组数据库，获得目标菌株或藻株的保藏编号.应向专业的菌种或藻种保藏机构申请或
5.1.2宿主细胞鉴定
细菌、真菌的鉴定按照NY/T1736执行.蓝细菌、真核微藻采用显微镜与分子鉴定方法相结合的手段进行鉴定：
a）显微镜鉴定方法：利用光学显微镜获得蓝细菌、真核微藻的形态特征，与权威科学文献中的 数据和描述进行比较，使用检索表进行鉴定：
b）分子鉴定方法：蓝细菌进行16SrDNA序列分析，真核微藻进行18SrDNA或ITS序列分析.
5.2生物合成途径设计
解析目标产物的生物合成途径，以此为基础设计对宿主细胞自身类胡萝卜素生物合成途径的改造方案，通过基因克隆或合成手段，引入经密码子优化的关键异源基因（常见基因见附录A），优化代谢流 提高类胡萝卜素前体物质供应，降低类胡萝卜素前体物质的旁路途径消耗.合成元件均需按照GB/T37873进行标准化质量评估.
5.3基因表达载体构建
5.3.1靶位点设计
根据目标基因的表达水平和表达特性，对比全基因组序列，根据宿主基因的来源、载体启动子的种类、转录本数量、蛋白功能域等选择适合的软件设计宿主基因上的靶位点（常见启动子及选择标记见附 录B）.
5.3.2载体构建
通过多基因共表达载体或染色体整合策略构建目标基因的表达载体.根据靶位点预测的结果，设计相应引物.根据基因组编辑的方式和对象选择适宜的载体，利用酶切连接或同源重组的方式将目标基因组装至表达单元中.
5.4DNA转化方法
5.4.1化学转化法
5.4.1.1酸酒酵母：将使用醋酸锂处理获得的感受态细胞100μuL、0.1μg~1μg质粒、变性的精DNA与聚乙二醇/醋酸锂试剂混合，30℃孵育30min后，可加入DMS0并在42C热激15min~20min，随即冰浴.最后离心涂布于营养缺陷型培养基，30C培养2d~4d.
5.4.1.2大肠杆菌：使用氯化钙处理获得感受态细胞，将100uL感受态细胞与1ng~100ng质粒DNA混合，冰溶30min后于42C热激90s，冰浴冷却后加入LB培养基复苏45min~60min，最后涂布于抗性平板，37℃培养过夜.
5.4.2自然转化法
photons/m²/s条件下孵育6h后涂布于无抗BG11平板，24h后转入抗性平板.用于同源重组的载体，其两 集胞藻PCC6803：收集培养至指数生长中期的细胞，加入0.5μg~5μg质粒DNA，在30℃，30μumo1侧同源臂的建议长度约为1000bp.
5.4.3细菌接合转移
鱼腥藻PCC7120：将含有接合质粒的大肠杆菌、含有运载质粒与辅助质粒的大肠杆菌1：1混合，混合菌液再与宿主细胞1：10混合，涂布于BG11抗性平板.
5.4.4电转化法
外源DNA混合，于无菌的4mm电击杯中，在电场强度0.6kV/cm~0.8kV/cm、脉冲时间约10ms的条件下进 莱茵衣藻：收集指数生长期的细胞，使用含60mM山梨糖醇的TAP液体培养基洗涤并重悬后，将其与行电击.电击转化后，藻液连同电击杯在冰上静置10min，后转移至含60mM山梨糖醇的TAP液体培养基过夜恢复，随后使用相应选择标记进行筛选.
5.5工程菌株的筛选和鉴定
5.5.1工程菌株筛选
基于选择性培养或报告基因筛选工程菌株，按照SN/T2667-2010中6.1和6.2执行.
5.5.2工程菌株鉴定
2667-2010中6.3执行.利用Sanger测序、下一代测序等方法准确检测工程菌株.进一步通过实时定量PCR 根据目标基因序列以及靶点位置，以提取的细胞基因组为模板，PCR扩增目的片段，具体按照SN/T和estern杂交等试验分析目标基因表达情况.
6性能评价指标
6.1生长性能
6.1.1细胞密度
野生型菌株、转入空载体的对照菌株和工程菌株的细胞密度采用平板计数法或分光光度法测定，无法采用上述两种方法测量的丝状藻则采用显微镜计数法测定.
6.1.2细胞干重
野生型菌株、转入空载体的对照菌株和工程菌株，离心收集菌体，经去离子水离心洗涤两次后，于
105℃烘干48h，称重.
6.1.3生长曲线
野生型菌株、转入空载体的对照菌株和工程菌株的生长曲线依据不同时间点的细胞密度绘制，针对
不同物种，应设定差异化的监测策略，典型菌株的推荐培养基（见附录C）与实验参数为：
a)酿酒酵母：采用YPD培养基，接种初始细胞密度0D为0.1，培养温度30℃，转速150rpm，b）大肠杆菌：采用LB培养基，接种初始细胞密度0D为0.1，培养温度37C，转速200rpm， 总时长24h~48h，间隔1.5h~2h；总时长12h~24h，间隔20 min~30 min;c）集胞藻PCC6803：采用BG11培养基，接种初始细胞密度0D为0.1，培养温度30C，转速150rpm，C0通气量1%~3%，总时长7d~10 d，间隔12h~24h；
