T/SAASS 体 标 准
T/SAASS342-2026
Technical code of practice for the isolation and preservation of yeast strains fromcorn starchwastewater
山东农学会 发布
前言
草. 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由山东省农业科学院提出.
本文件由山东农学会提出并归口.
本文件起草单位：山东省农业科学院、山东爱福地生物股份有限公司、青岛和协生物科技有限公司、山东种业智科农业服务集团有限公司、赤峰市宁城县农牧局.
本文件主要起草人：陈高、康佳、邵亚会、宣宁、耿耘、边斐、张樱馨、杨文龙、魏祥圣、倪海平、赵红军、王贤举、李鹏、陈秋明.
玉米淀粉废水中酵母菌菌种分离与保藏技术规程
1范围
操作方法和质量控制的要求. 本文件规定了玉米淀粉废水样品中分离、纯化、鉴定酵母菌，以及进行短期和长期保藏的技术要求、
本文件适用于玉米淀粉废水环境中分离和保藏的酵母菌菌种.
2规范性引用文件
件，仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文于本文件.
GB4789.28食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求 GB19489实验室生物安全通用要求
NY/T1736微生物肥料菌种鉴定技术规范
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3. 1
玉米淀粉废水corn starchwastewater
在以玉米为原料生产淀粉及其衍生物的过程中，主要来自浸泡、胚芽分离、纤维洗涤等工序所产生的高浓度有机废水.
4仪器与试剂
4.1仪器设备
无菌采样器、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、恒温摇床、光学显微镜、PCR仪、电泳仪、冷冻离心机、冰箱、超低温冰箱-80C、液氮罐、pH计、天平、移液器.
4.2培养基与试剂
基亚矾（DMSO）、革兰氏染色液、美兰染色液、氯霉素、庆大霉素等，所用试剂纯度应为化学纯或以上. YPD培养基、麦芽汁培养基、孟加拉红培养基、无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液（PBS）、甘油、二甲相关培养基配方见附录A.
5总体技术流程图
图1玉米淀粉废水酵母菌株筛选与保藏整体的流程图
6样品采集与预处理
6.1采样位点
层或池底沉淀物过多处采集. 应选择在玉米淀粉生产企业废水处理站的后端能代表综合水质的位置进行采样.避免在水面浮渣
6.2采样工具与容器
使用无菌玻璃瓶或聚乙烯塑料瓶作为采样容器.采样前，容器应清洗干净并经121C、20min高压蒸汽灭菌.采样时应佩戴无菌手套.
6.3采样方法
采用瞬时采样法，将采样瓶口对准水流方向，浸入液面下20cm~50cm处，打开瓶盖.让废水充满容器，严格遵循无菌操作规范，尽量减少外部污染，并确保样品充满整个容器以降低氧气残留.
6.4样品记录与标识
样品应在4h内送达实验室进行预处理：若不能及时送达，需在4C条件下冷藏保存与运输，且保存时间 采样后应立即贴上标签，注明样品编号、采样地点、采样时间、采样人等信息，并填写样品登记表.不宜超过24h.
6.5样品预处理
6.5.1初步过滤
到达实验室后，应立即使用无菌纱布或定性滤纸对废水样品进行初步过滤，以去除样品中残留的颗粒性杂质如淀粉颗粒、纤维等.
6.5.2富集与调节
根据废水具体性状及目标酵母菌的特性，可选择以下一种或多种方法进行预处理：
a)高浓度有机废水的稀释处理：若样品化学需氧量（COD）较高，应使用无菌生理盐水进行10倍 梯度稀释：若初步稀释后浓度仍偏高，可进一步提高稀释倍数，直至样品COD预估浓度低于后续检测方法的线性范围上限.通常建议将样品稀释至1000mg/L以下，再进行后续预处理：b）pH调节：使用无菌的NaOH或HC1溶液将样品pH值调节至4.5~5.5，以抑制细菌生长并有利 于酵母菌增殖：c）营养补充：可根据需要向样品或其上清液中加入0.5%~2%（w/v）无菌葡萄糖或0.1%~0.5%d）富集培养：将上述处理后的样品置于恒温摇床中，在25℃~28℃、120rpm~150rpm条件下培 （w/v）酵母浸粉，以促进酵母菌生长：养24h~48h，实现酵母菌的初步富集：e）静置沉淀：取富集后的样品，于4C静置1h~2h，取上清液进行后续操作：f）离心浓缩：取部分上清液或富集液，在4C、5000rpm~8000rpm条件下离心10min~15min， 收集菌体沉淀，用无菌生理盐水重悬，用于后续分离.
6.5.3预处理后样品的保存
经预处理后的样品或富集液应尽快用于酵母菌的分离.若需短暂保存，应置于4C冰箱，且不宜超过12h.
7分离与纯化
7.1分离
7.1.1分离方法
采用稀释涂布法或划线分离法进行分离.优先使用稀释涂布法，该方法便于后续的菌落计数与单菌落挑取.操作时，对样品进行10～10梯度稀释，并选择2个～3个适宜的稀释度进行涂布，以确保获得清晰、可计数的单菌落.
7.1.2培养基
先使用YPD培养基.为抑制细菌生长，可在培养基中加入适量过滤除菌的氯霉素或庆大霉素，使其终浓 使用适合于酵母菌分离的选择性培养基，如高糖废水样品优先使用麦芽汁培养基，高氮废水样品优度分别达到50μug/ml，具体方法按照GB4789.28的规定执行.
7.1.3培养与观察
将涂布或划线后的平板倒置于28C~30℃恒温培养箱中培养48h~72h.每日观察菌落生长情况，挑取不同形态，如圆形、隆起、边缘整齐、表面光滑/粗糙、颜色等疑似酵母菌单菌落，并进行标记.
7.2纯化
7.2.1纯化方法
态一致的纯培养物. 对初分离的疑似单菌落，采用平板划线法进行至少两次的重复纯化，直至在显微镜下观察证实为形
7.2.2镜检
挑取少量纯化后的酵母菌菌体，制作水压片，并使用关兰染液进行染色.随后于光学显微镜下进行形态学观察.酵母菌属于单细胞真核微生物，镜下可见其细胞形态多为圆形、卵圆形或椭圆形，并常可观察到典型的出芽繁殖现象.
