中华人民共和国国家标准
GB/T28642-2012
Rapid determination of Salmonella spp.in animal feeding stuffsPCR method
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）归口. 本标准起草单位：农业部饲料质量及畜产品安全监督检验测试中心（沈阳）.本标准主要起草人：张秀芹、张建助、杜柏林、李欣南、杨希国、马俊驰、陈晓月.
饲料中沙门氏菌的快速检测方法 聚合酶链式反应（PCR）法
1范围
本标准规定了饲料中沙门氏菌的快速检测的PCR方法.本标准适用于饲料中沙门氏菌的定性筛选.
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GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T13091饲料中沙门氏菌的检测方法 GB/T14699.1饲料采样GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1193基因检验实验室技术要求SN/T1870食品中致病菌检测方法实时PCR法
3原理
利用沸水浴使菌体细胞破裂，释故基因组DNA，离心使细胞壁等有形物沉淀，以上清液为模板进行扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物.
4试剂和材料
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，试验用水符合GB/T6682的要求.
4.1沙门氏菌检测用引物（对）序列为： Sal F:5'-TCG CAC CGT CAA AGG AAC CGT AAA GC-3Sal R;5′-GCA TTA TCG ATC AGT ACC AGC CGT CT-3'各0.4 mmol.4.4 Marker 20004.5缓冲蛋白陈水（BPW）：见A.1.4.6大豆蛋白陈肉汤（RVS）：见A.2.4.7亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）：见A.3.4.9质控菌株：沙门氏菌阳性标准菌株. 4.810倍上样缓冲液（10×loadingbuffer）：0.05%的溴酚蓝，50%丙三醇溶液，1%的SDS.4.1050×TAE缓冲液：见A.4
4.3琼脂糖：电泳级.
GB/T 28642-2012
4.111XTAE缓冲液：见A.5.4.12溴化乙锭（5mg/mL);见A.6.注：4.2和4.8缓冲液为商品化成品.以上用于PCR反应及电泳试验的试剂可用功能相当的其他产品替代.
5仪器设备
5.3离心机：离心转速12000g.5.4微量移液器.5.6凝胶成像仪. 5.5电泳仪.5.7天平：感量0.01g.5.8电热恒温培养箱.
5.1PCR仪.
5.2恒温水浴锅.
6试样选取与制备
品人为污染.
7检验步骤
7.1样品的增菌及模板的制备
取25g样品于225mL的缓冲蛋白陈水（BPW，4.5）中，37℃土1C培养18h±2h进行预增菌，取0.1mL预增菌液转移至10m1.大豆蛋白陈肉汤（RVS.4.6）培养基内，41.5C±1C培养24h土3h. 同时取10mL预增菌液于100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC，4.7）中37℃±1C培养24h±3h，进行选择性增菌，取选择性增菌液1mL于离心管中10000g离心10min，弃上清，1mL无菌去离子水悬浮离心10min，弃上清，再用0.2mL无菌去离子水悬浮，95C水浴20min，将离心管迅速转移至冰浴中使其迅速冷却，用涡旋仪混匀裂解物.20℃～25C下10000g离心3min，转移上清至新鲜管中备用 （模板制备可选用商业试剂盒）.检测过程中分别设阳性对照和阴性对照，用添加沙门氏菌阳性标准菌株的样品作阳性对照，用不含沙门氏菌的样品作阴性对照.
7.2PCR扩增
50μL的反应体系，在0.2mL的反应管中，PremixTaq缓冲液（4.2）25L，模板4yL，浓度为20μmol/L的上下游引物各1pL 去离子水19μL.
72C终延伸7min后4C保存.
7.3电泳检测PCR扩增产物
取1.5g琼脂糖（4.3），于100mL1×TAE缓冲液（4.11）中加热，充分熔化，冷至65℃左右的时候，加人10μl澳化乙锭（4.12），充分混匀，根据需要在模板内放人合适的梳子，制成约5mm厚的胶块.在电泳槽中加人1×TAE缓冲液，使液面没过凝胶2mm~3mm.将6L~8μL的PCR扩增产 物与1pl10倍上样缓冲液（4.8）混合后点样，取6pLMarker2000（4.4）点样.5V/cm~8V/cm恒压电泳，直至澳酚蓝指示剂迁移至凝胶中部，用成像仅进行凝胶成像.
8结果表述
在330bp处未出现相应大小的扩增条带，则可报告待测样品未检出沙门氏菌：如待测样品在相应处出现扩增条带，则为疑似阳性样品，此时需用GB/T13091进行确证，最终结果以后者检测结果为准.对于疑似阳性样品，可以对其扩增产物进行测序，结果参照附录B.
重新进行检测并排除污染因素. 如果阴性对照出现条带和（或）阳性对照未出现预期大小的扩增条带，本次待测样品的结果无效，应
9检测过程中防止交叉污染的措施
按照SN/T 1193、SN/T 1870和GB 19489的要求执行.
10康弃物处理
检测过程中的废弃物及一切可能被污染的物品均应做无害化处理.
