中华人民共和国国家标准
GB/T28975-2012
Detection and identification of lettuce mosaic virus-Nanoparticles-enlarged incolloidal gold immunochromatographic assay
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草. 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局.本标准主要起草人：李锦丰、陈艳、马吉湘、田世民、戴华、张帆、金涌、邹明强.
引言
本文件的发布机构提请注意，申明符合本文件时，可能涉及到6.4.3、B.4与增敏试剂相关的专利的使用.
本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场.
该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判，该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案.相关信息可以通过以下联系方式获得：
该专利持有人：中国检验检疫科学研究院
联系人：邹明强
地址：北京市朝阳区高碑店北路甲3号中国检验检疫科学研究院邮编：100123
请注意除上述专利外，本文件的某些内容能够仍可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.
莴苣花叶病毒检疫鉴定方法纳米颗粒 增敏胶体金免疫层析法
1范围
本标准规定了用纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法检测莴苣花叶病毒的原理、实验步骤及结果判定等.
本标准适用于植物及其产品组织中莴苣花叶病毒的快速筛查.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB19489实验室生物安全通用要求GB/T236292009引进植物病原生物安全控制技术要求GB/T23632-2009进境植物检疫截获有害生物鉴定复核规程
3莴芭花叶病毒基本信息
中文名：莴苣花叶病毒学名：lettuce mosaic virus缩写：LMV分类地位：马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirux）.
莴苣花叶病毒的其他信息参见附录A.
4方法原理
胶体金免疫层析试纸条进行处理，提高检测灵敏度，根据试纸条颜色的变化，判定待测样品中是否存在 基于胶体金免疫层析双抗体夹心检测法原理，采用氯金酸与还原剂反应生成的纳米金颗粒对常规窝苣花叶病毒.
5仪器设备、用具及试剂材料
5.1仪器设备
天平（感量，1/10000g）离心机、组织热碎机、低温冰箱等.
5.2用具
微量移液器（2.5L、10L、20μL、100μL、200μL、1000L)、研体、离心管等.
5.3试剂材料
纳米颗粒增敏胶体金免疫层析法测定莴苣花叶病毒试剂材料（见附录B).
6实验步骤
6.1生物安全与废弃物处理
实验过程中的生物安全要求应严格按照GB19489的规定进行操作，实验废弃物按照GB/T236292009中5.7进行处理.
6.2样品制备
称取1g植物或其产品组织.加入2mL样品提取缓冲液用研体研磨，然后4℃下3000g~5000g离心10min，取上清液制备成一个样品.
6.3样本存放
冻融.
6.4病毒检测
6.4.1检测步骤
取同一批次胶体金免疫层析增敏快速检测试纸条（即开即用），置于平整的台面上，向样品垫中分别加人被检样品、阳性对照和阴性对照各100gL，每个试验同时做平行.室温放置15min，观察检测线和质控线条带.
6.4.2质量控制
质控线条带出现颜色，阳性对照检测线条带出现颜色，阴性对照检测线条带不出现颜色，检测结果有效.如果质控线条带不出现额色，或阳性对照检测线条带不出现颜色，或阴性对照检测线条带出现颜色，出现任何一种现象以上者，说明检测结果无效，另选一批次试纸条重新按6.4.1操作.
6.4.3增敏实验
向检测线没有产生颜色条带的试纸条样品垫上加人100pL的PBST缓冲溶液进行清洗，反复清洗3次，每次1min.然后在硝酸纤维素膜靠近结合垫端加人30pL增敏试剂，室温反应5min~8min后，观察检测线条带颜色.
6.4.4结果判定
检测线条带出现额色，判定为阳性：检测线条带不出现颜色，判定为阴性.注：增敏前条带颜色为红色，增敏后因为氧化还原反应使条带额色变为黑灰色.
7结果的确认
可疑阳性样品应采用莴苣花叶病毒RT-PCR检测方法进行确认.
