T/ZJSC2025-0022
大黄鱼5种细菌性病原快速检测 环介导 等温扩增微流控芯片法
Rapid detection of five bacterialpathogens inlarge yellow croak-Loopmediatedisothermalamplification integrated microfluidic chip method
浙江省水产学会 发布
前言
起草. 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定
请注意本文件的某些内容有可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.
本文件由浙江省水产学会提出并归口.
本文件起草单位：宁波大学、浙江省海洋水产养殖研究所.
本文件主要起草人：陈炯、周前进、闫茂仓、聂力、王瑶华、陈琛.
大黄鱼5种细菌性病原快速检测环介导等温扩增微流控芯片法
1范围
本文件规定了大黄鱼5种细菌性病原快速检测的环介导等温扩增微流控芯片法的原理、材料和试剂、仪器和设备、检测步骤、结果判定、生物安全要求.
本文件适用于大黄鱼变形假单胞菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、恶臭假单胞菌5种致病菌的快速检测.其他水生动物可参照执行.
2规范性引用文件
仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本 下列文件中的内容通过文中的规范性引用面构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件，文件.
GB4789.7食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检验 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫 GB/T41521多指标核酸恒温扩增检测微流控芯片通用技术要求SN/T4624.17入境环保用微生物菌剂检测方法第17部分：恶臭假单胞菌SN/T5336猪瘟病毒及非洲猪瘟病毒检测微流控芯片法
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义.
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件.
EDTA:乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid)FEN：结构特异性核酸内切酶（flap structure-specific endonuclease）Tris-HCl：三羟甲基氨基甲烷-盐酸（tris（hydroxymethy1）aminomethane-hydrochloric acid）
4原理
选取5种病原菌的特征性基因（gyrB、ompk、vhhA、TI和oprD）作为靶标，设计LAMP引物并预包埋于微流控芯片反应池中.提取自样品的DNA，与LAMP反应液混合，加入芯片并密封，通过微流控芯片核酸检测仪在恒温扩增条件下完成反应，并实时监测荧光信号.目标核酸若存在，扩增产物与荧光染料结合后形成典型S型荧光曲线.根据曲线变化趋势，判定样本中是否含有相应病原菌.
5材料和试剂
5.1材料
5.1.1微流控芯片：4X8离心式微流控芯片，5口L/反应池.
5.1.2其他耗材：热封膜、封口膜（应符合SN/T5336）：无核酸污染的移液器吸头（10uL、200uL、1000uL）、无核酸污染的离心管（1.5mL、2mL）等.
5.2试剂
本文件中化学试剂，除非另有规定，仅为分析纯试剂.
5.2.1实验用水符合GB/T6682要求的一级或二级水.5.2.23%氯化钠碱性蛋白陈水（见附录B）. 5.2.3核酸提取试剂，包括抽提缓冲液、20mg/mL蛋白酶K、Tris饱和酚、10mo1/L乙酸铵、Tris-EDTA缓冲液（见附录B），或使用等效的商品化试剂盒.
5.2. 4引物：每套LAMP引物，包括100 μmol/L F3、100μmol/L B3、200μmol/L FIP、200μmol/LBIP，可包括200μmol/LLF和/或200μmol/LLB（见附录A）.合成后的F3、B3、LF、LB经聚丙烯酰 胺凝胶电泳（PAGE）纯化，FIP和BIP纯化使用高效液相色谱（HPLC）.
5.2.5阴性对照、阳性对照、内参对照.
a）阴性对照：从未感染目标病原的大黄鱼组织提取的核酸：b）阳性对照：从感染目标病原的大黄鱼组织提取的核酸或人工合成的含有目标核酸序列的DNA片段：c）内参对照：含非病原序列的质粒与配套引物.内参质粒和引物预置于芯片反应池中.
5. 2. 6LAMP反应试剂：20 mmo1/L TrisHC1(pH 8. 8) 10 mmo1/L KC1 10 mmo1/L (NH)S0 ，8 mmo1/LMgSO 0. 1% (v/v) 吐温20 1. 4 mmo1/L dNTPs 8000 U/mL Bst DNA聚合酯 0. 5 mg/mL FEN 50 μ mo1/LSYBR Green 1，内参质粒（100 copies/uL）.亦可使用经验证的等效的商品化的LAMP反应试剂盒.
6仅器和设备
6.1微流控芯片核酸检测仪.
6.2高速离心机：能够降低至4℃，最大转速可达12000rpm
6.3天平：感量0.01g.
6.4恒温金属浴或水溶锅：100C土1℃，
6.5低温冰箱：-20℃.
6.6控温摇床：-15℃C~80C，土0.1C：能满足转速180rpm~220rpm，振幅择20m~25mm（回旋式）.
6.7移液器：量程：0.5μL~10μL、10μL~100μL、100μl~1000μL.
6.8无菌11级生物安全柜.
7检测步骤
7.1样品采集与准备
应符合GB4789.7的规定.
7.2细菌基因组DNA提取
7.2.1增菌应按照GB4789.7的规定执行.
7.2.2使用煮沸法提取细菌基因组DNA
a）用1.5mlL无菌离心管新制备的增菌液1mL，10000rpm离心1min，弃上清液.
b）细菌沉淀加入1mL无菌水，充分悬浮沉淀，10000rpm离心1min，弃上清液.
c）加入100uL无菌水，充分悬浮沉淀后，放入沸水浴10min，迅速置于冰水中冷却5min.
d）菌体混悬液，混匀后，再次放入沸水浴10min，迅速置于冰水中冷却.
e)12000rpm离心2min～3min，收获上清即为细菌DNA模板.也可采用等效的商品化DNA提取试剂盒并按其说明提取DNA.
7.2.3使用有机溶剂提取法提取细菌基因组DNA
应按SN/T4624.17的规定执行.
7.3大黄鱼组织DNA提取
b）加入2.5uL20mg/mL的蛋白酶K，充分混匀后50℃3h，间接性颠倒混匀. c）将溶液冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚，颠倒混匀10min，10000rpm离心5min，分离水相和有机相.
10000rpm离心1min分离水相和有机相. d）水相移至新的1.5mL离心管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），颠倒混匀10min，
e）水相移至新的1.5mL离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），颠倒混匀10min，1000rpm离心1min分离水相和有机相，
预冷的无水乙醇混匀，-20C静置2h.10000rpm离心10min，弃上清液. f）水相移至新的1.5mL离心管中，加入100口L10mo1/L乙酸铵，混匀后，再加入2倍体积（-20C）
g）70%乙醇洗涤沉淀2次，每次10000rpm离心5min，弃上清液.无色透明的DNA沉淀于室温晾干.
h）加入100uL灭菌的无菌水溶解DNA，备用，或者溶解于100uL灭菌的TE缓冲液并保存于-20℃.
i）同等抽提效果的其他方法或使用商品化DNA抽提试剂盒.
7.4微流控芯片检测
7.4.1微流控芯片的制作
a）微流控芯片的制作应符合GB/T41521的规定.
b）引物预混：引物按照如下比例进行预混：F3：B3：FIP：BIP：LF：LB=1：1：4：4：1：1，统菌水替代. 一稀释1000倍，充分混匀，形成引物预混液.若检测过程中，不使用LF或LB，用等体积的不含DNA的无
c）引物包埋：在无菌Ⅱ级生物安全柜内，使用移液器将10uL引物预混液精准滴加至微流控芯片的指定反应池中，每个反应池对应一个特定靶基因.完成点布后，于室温下自然干燥约30min.干燥完 成后，使用热封膜进行封装，制备成微流控芯片.
注：用于内参对照的质粒与其配套引物同步滴加至预设的内参反应池中.
7.4.2反应体系配制
25uL反应体系，包括LAMP反应试剂14.8uL、DNA模板2uL，余量以无菌水补足.将各组分加入1.5mL离心管，涡旋混匀后瞬时离心.
7.4.3加样与封片
将配制的反应体系全部加入到微流控芯片的加样孔，用封口膜封住加样孔与排气孔，使用刮片赶走封口膜处气泡，确保封口膜完全贴合密封.
7.4.4LAMP反应与检测
将封好膜的微流控芯片迅速放置于适配的微流控芯片核酸检测仪，按1600rpm低速离心10s，4600rpm高速离心30s，65C等温扩增60min.
8结果判定
8.1检测阅值线设置
