中华人民共和国国家标准
GB/T29393-2012
Detection and identification of Candidatus liberobacterasiaticum
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草. 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口.本标准起草单位：全国农业技术推广服务中心、浙江省植物保护检疫局.本标准主要起草人：吴立峰、严铁、林云彪、项宇、朱景全、朱莉.
柑桔黄龙病菌的检疫检测与鉴定
1范围
本标准规定了柑桔黄龙病菌亚洲种Candidatuslibrrobacter axiaricam jagoueix el al.的检测与鉴定方法.
本标准适用于植物检疫过程中对柑桔黄龙病菌亚洲种的检测与签定.
2病菌基本信息
中文名：相桔黄龙病菌.学名 ：Candidatus liberobacter asiaticam jagoueix et al.病害英文名：Citrus Huanglongbing HLB.
属薄壁菌门Gracilicutes、阔皮部杆菌属Liberobacter.
3方法原理
citri）传病后，可根据木本指示植物发病症状鉴定：聚合酶链反应（Polymerase ChainReaction，PCR）检 根据柑桔黄龙病菌侵染柑桔植株发病典型症状进行田间鉴定：经嫁接或经柑桔木虱（Diaphorina测技术对柑桔黄龙病菌DNA进行体外扩增，可得到快速、有效的鉴定结果.
4仅器及用具
紫外线透射仅或凝胶成像系统，离心机，核酸电泳仪，pH计，移液器：10gl、20μl、100pl、1000pL，PCR仪，水浴器、超纯水系统，电子天平.
5试剂与材料
TAE缓冲液，三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸（Tris-HCI），乙二胺四乙酸（EDTA），十二烷基硫酸钠（SDS），乙酸钠（NaAc），Tag酶，10×PCR缓冲液，25mmol/L镁离子（Mg），20mmol/L脱氧核苷三磷酸（dNTP)，5pLDNA荧光染料（GV)，琼脂糖，溴酚蓝，高锰酸钾，三氯甲烷（氯仿），异戊醇，异丙醇，乙醇.
6症状识别法
柑桔黄龙病主要鉴定依据是田间出现的“叶片斑驳型黄化"和“黄梢”.叶片斑驳型黄化即叶片转绿后从主、侧脉附近和叶片基部开始黄化，黄化部分扩展形成黄绿相间分布不均的斑驳，后来可以全叶黄化.黄梢即在发病初期，绿色树冠上少部分新梢枝叶片黄化.有些柑桔结果树果实呈“红鼻子果”，在 柑桔黄龙病区符合上述典型症状的病苗、病树可直接鉴定为柑桔黄龙病.
对难以下结论的疑似病苗、病树，可根据具体情况选用以下一种或儿种检测方法进行鉴定.
7指示植物鉴定法
7.1指示植物鉴定柑桔接穗带菌
（嫁接工具每次使用前用高锰酸钾溶液消毒）.待嫁接愈合后，在其上方约1cm处剪除指示植物的主 以柑作指示植物.鉴定时用带有2～3个病芽的接穗，在健康碰柑实生苗上进行嫁接.重复3次干.每株疑似病株至少嫁接30株以上健康柑，以健康槎柑实生苗作对照，定期观察、记载指示植物新抽枝叶的症状.一般柑桔黄龙病在指示植物上的潜育期为4～12个月.符合第6章所描述的发病症状可鉴定为柑桔黄龙病.
7.2指示植物鉴定柑桔木虱带菌
从田间疑似病株上，采集柑桔本虱成虫50～100头，接到指示植物槎柑上饲养，定期观察、记载指示植物症状.符合第6章描述的发病症状可鉴定接种相桔木虱带有相桔黄龙病菌.
8PCR检测法
8.1取样
取样包括疑似柑桔黄龙病叶片和柑桔本虱成虫二类.采集疑似柑桔黄龙病叶每样品20张叶片直接故于信封内（切忌塑料袋包装），采集无病树和病树枝梢上相桔木虱成虫每样品50～100头，置于70%乙醇内浸泡2h~3h，然后取出放于塑料管内，供检测，样品可放人4C冰箱保存.
将取样情况填入（植物有害生物调查抽样记录表）（见附录A）.
8.2方法
按附录B的规定进行.
8.3结果及判定
每次扩增反应均设空白对照、来源可靠的阳性对照和不含病原DNA的阴性对照各1个，每个样品均进行3次重复.如果阳性对照电泳后出现一条563bp特异性条带，阴性对照和空白对照电泳后没有条带试验结果成立否则，结果不成立.
在试验结果成立的前提下，供试样品出现与阳性对照一样的条带，样品判定为阳性，即检出柑桔黄龙病菌；供试样品未出现与阳性对照一样的条带，样品判定为阴性，即不带柑桔黄龙病菌.
9记录与档案
将检测结果填入表格（植物有害生物样本鉴定报告）（见附录C），将检测的有关数据、图片等资料整理保存.
10标本保存
柑桔叶片放人4℃冰箱保存和柑桔木虱浸70%乙醇保存.
附录A
（规范性附录）植物有害生物调查抽样记录表
表A.1植物有害生物调查抽样记录表
编号：
生产/经营者 联系/负责人 地址及邮编 联系电话调查日期 抽样地点样品 品种 调查代表编号 植物名称（中文名和学名） 名称 植物生育期 株数或面积 植物来源症状捕述：发生与防控情况及原因：抽样方法、部位和抽样比例：备注：抽样单位（盖章）： 生产/经营者填表人（签名）： 现场负责人年月日 年月日注：本单一式两联，第一联抽样单位存档，第二联交受检单位.
