中华人民共和国国家标准
GB/T29397-2012
Detection and identification of Fusarium oxysporumf.sp.Cubense（E.F.Smith）Snyder & Hansen Race 4
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草. 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口本标准起草单位：全国农业技术推广服务中心、广东省植物检疫站、华南农业大学.本标准主要起草人：王玉玺、王琳、吴立峰、姜子德、李敏慧、任小平、李小妮、吴仕豪.
香蕉枯萎病菌4号小种检疫检测与鉴定
1范围
本标准规定了香蕉枯萎病菌4号小种[Fusariam orysporum f. sp.Carbense(E.F.Smith）Snyder&HansenRace4的现场检验和实验室检测鉴定以香蕉枯菱病菌4号小种的为害症状、病原菌形态、致病性测定结果、Komada改良培养基上的菌落性状和寄主范围为依据，明确了现场查验、实验室鉴定、菌种 保存的方法.
本标准适用于香蕉（包括香蕉、大蕉、粉蕉等香蕉枯萎病菌4号小种易感品种）生长期间的香蕉枯萎病菌4号小种的检测.
2原理
根据香蕉枯萎病菌4号小种的为害症状，取病健部交界组织分离培养病原菌，根据病原菌形态、致病性测定结果、疑似病菌在Komada改良培养基上的菌落性状进行判定.
3位器、用具及药品
3.1仪器、用具
仪器：超净工作台、培养箱、光学显微镜、高压灭菌、照相机等.
用具：铲、枝剪、砍刀、纸袋、油性笔、记录本、标签纸、小刀片、培养Ⅲ、载玻片、盖玻片、镊子、挑针、酒精灯等.
3.2药品
0.1%升汞、70%乙醇、无水乙醇、灭菌水、去离子水、40%甘油、磷酸氢二钾、氯化钾、7水硫酸镁、乙10%磷酸等. 二胺四乙酸铁钠、L-天门冬酰胺、半乳糖、琼脂粉、75%五氯硝苯可湿性粉剂、牛胆粉、硼砂、硫酸链霉素、
4现场查验
4.1现场调查
4.1.1调查范围
香蕉种植地及香蕉试管苗二级苗生产和销售场地.
4.1.2调查方法
对香蕉枯菱病菌4号小种的寄主植物进行踏查，观察其生长状况：向香蕉种植者和管理人员询间，确定疑似香蕉枯萎病菌4号小种为害的田块，对疑似田块进行现场检验.
4.1.3症状识别
对地上部表现症状的植株，剖开其根部和假茎部维管束组织，观察是否发生颜色变化.
对地上部无明显症状的植株，随机抽取部分植株，观察其根部及假茎部位维管束组织是否发生颜色变化.
症状表现参见附录A.
4.2样本的采集
采样前需对取样现场及病害症状拍照.
疑似病株的取样应选取症状典型、中等发病程度的植株，取样部位包括蕉头病健部交界组织（8cm×8cm）、根、假茎（长20cm）、叶柄；对二级苗应取整个植株，样品采用坚韧纸质材料包裹，切勿采用塑料薄膜包裹.样品应附上采集时间、地点、品种的记录和田间照片.采样后填写附录B.
5实验室检测鉴定
5.1病原菌的分离与培养
取病键部交界组织，切成小块（2mm×3mm），将小块组织先放于70%乙醇溶液中浸5s、再转人0.1%升汞溶液中浸泡1min~2min进行消毒处理，然后用灭菌水漂洗3次：将消毒处理和漂洗后的小块组织置于PDA或PSA平板上恒温（25C）培养，菌落白色絮状，基质淡紫或淡紫红色；培养5d~7d 可产生大量小型分生孢子，培养10d～15d可产生少量大型分生孢子，培养30d后有厚垣孢子形成.结果符合附录A形态描述的，可继续按5.2的方法进行病原菌致病性测定.
5.2病原菌致病性测定
采用伤根浸菌接种法.将4～5叶期健康组培香蕉苗（巴西蕉或广东香蕉2号）自沙床中拔出，然后用缓慢流出的自来水冲洗根部以去除附在其根上的沙子，再分别浸在配制好的各分离菌株孢子悬浮液中（孢子浓度不低于1×10个/mL），以清水做对照，30min后移裁到盛有灭菌细沙的营养杯，置于温室（25℃~32C），15d~20d后观察结果.霍病蕉苗如表现出附录A的症状.对病株进行组织分离，应得到与原接种菌相同培养性状和形态特征的病原菌.按照柯赫氏法则，可初步确定该病原菌为尖孢刀菌古巴专化型4号小种.
5.3在Komada改良培养基上的菌落性状
5.3.1Komada改良培养基的配制
融化900mL基本培养基[磷酸氢二钾.1g：氯化钾，0.5g：硫酸镁，0.5g；乙二胺四乙酸铁钠，0.01g:L-天门冬酰胺，2g：半乳糖，10g；琼脂粉，16g:去离子水定容至900mL，高压灭菌]，在无菌操作下与100mL的盐溶液（5%五氯硝苯可湿性粉剂，0.9g；牛胆粉，0.45g；硼砂，0.5g；硫酸链霉素，0.3g：用10%磷酸调pH值到3.8土0.2）混合，倒平板.
5.3.2Komada改良培养基上菌落特征
将经5.1测定的疑似病菌的单孢分离菌株接于Komada改良培养基平板上，25℃、40W普通日光灯相距约30cm照射下培养10d后观察菌落性状，4号小种的菌落边缘为裂齿状，而1号小种及其他的
镰刀菌的菌落边缘则平滑，如图1.
图11号和4号小种在Komada改良培养基上的菌落形态（左图为4号小种，右图为1号小种.）
6结果判定
根据病原菌的形态学、致病性测定，及疑似病菌在Komada改良培养基上菌落边缘出现齿状的特征，按照柯赫氏法则可确定该病原菌为尖孢镰刀菌古巴专化型4号小种.
将实验室检测鉴定结果填人《植物有害生物样本鉴定报告（见附录C）.
7菌种的保存
鉴定人，并将菌株移至40%甘油管保存在一80C冰箱：或将菌株培养在试管斜面上，长满后存于4℃ 对判定为香蕉枯萎病菌4号小种的菌株进行标注，包括菌株来源、寄主的品系、采集时间、采集人和冰箱.
