中华人民共和国国家标准
GB/T29585-2013
Detection and identification of Anguina agrostis(Steinbuch）Filipjev
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国青岛出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：王金成、杨秀丽、崔铁军、张治字、刘鹏、廖芳、张裕君、牛春敬.
剪股颖粒线虫检疫鉴定方法
1范围
本标准适用于草籽及其他植物材料中剪般颖粒线虫的检疫及其鉴定. 本标准规定厂剪股颖粒线虫的检疫和鉴定方法.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3剪股颖粒线虫基本信息
中文名称：剪股额粒线虫.
英文名称：bentgrass nematode.
学名：Angaina agrostis (Steinbuch 1799) Filipjev.1936.
分类地位：线虫门（Nematoda）侧尾腺纲（Secernentea）、垫刃目（Tylenchida Thorne，1949）、粒线虫科[Anguinidae Nicoll 1935（1926)]、粒线虫属(Anguina Scopoli 1777).
带虫种子、虫、植物病残组织是剪股颖粒线虫传播的主要载体.
剪股额粒线虫的其他信息参见附录A.
4方法原理
现场检测获取样本，通过显微镜观察和分子生物学方法获取形态和核酸信息鉴定特征，进行鉴定.
5位器、用具
水仪.5.2用具：线虫挑针、载玻片、盖玻片、酒精灯、移液器（1000μL、100pL、10μL、2.5μL）、钟面Ⅲl （7cm、$9cm）、培养Ⅲ（g7cm、§9cm）、浅盘、套筛（400目、500目）、改进的贝尔曼漏斗、加热板、打孔器、解剖刀.
5.1仪器：显微镜（100×～1000×，具有目镜测微尺或绘图仪、图像捕获装置、测量软件）、体视显微镜（10×~80×，具透射光源）、冰箱、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、低速离心机（1000r/min~5000r/min）、纯
6试剂
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂或双蒸水.
6.1玻片封固剂、4%甲醛溶液、石蜡.
GB/T 29585-2013
6.210×PCR缓冲液（-20C保存）、25 mmol/L 氯化镁（-20“C保存）、2.5 mmol/L dNTP”s（20℃保存）、5U/uLTag 酶（-20C保存）、TAE或TBE电泳缓冲液、琼脂糖、澳酚蓝载样缓冲液（6×TAE缓冲液、60%甘油、0.3%溴酚蓝，4C保存）、溴化乙锭（EB，避光保存）DNAIaddermarker（20C保存）.
6.3剪股颖粒线虫rDNA-ITS质粒克隆（-20℃C保存）.
7现场检测
7.1抽样
按照SN/T2122抽取进出境的草籽、植物样品.
7.2外观症状的检查和取样
剪股额粒线虫主要侵染植物的花序，被寄生的小花的颖片、外存和内科显著伸长，其内的子房变成雪茄状的虫接：虫瘦开始形成时为绿色，后变为福色.收集上述可疑的草籽、植物材料带回实验室检验.
8实验室检验
8.1线虫分离
8.1.1浅盘和漏斗法：直接分离待检样品，室湿（25C左右）条件下分离12h~24h.可获得线虫.线虫.
8.1.2人工筛检虫裹：对于草籽，除浅盘和漏斗法直接分离样品外，可根据剪股颖粒线虫危害寄主引起的症状特点人工挑拣虫，获得虫瘦后，在清水中浸泡1h～2h，体视显微镜下挑针轻压，也可获得
8.2显微观察、摄影和测量
在体视显微镜下挑取线虫若干条制成临时玻片在显微镜下镜检，观察线虫的形态结构.同时对线虫进行拍照、测量.当虫量足够时，拍摄测量的雌虫、雄虫或幼虫数目应在15条以上.
8.3分子生物学检测
对形态学观察可疑的线虫幼虫应进行分子生物学检测.
9鉴定与检测
9.1形态学鉴定
9.1.1粒线虫属形态鉴定特征
成熟雌虫肥大，体型中等到大，长1mm～2.7mm，呈螺旋形.中食道球有瓣；后食道腺膨大，与狭部之间连续或丝缩，通常覆盖肠，偶尔不覆盖肠，维虫卵巢前部转折，卵母细胞围绕一中轴多行排列，子宫柱状部由多行不规则细胞排列构成.雄虫精原细胞多行排列：有引带；交合伞亚端生，长但不伸到尾端.一般在寄主植物地上部形成虫接.
9.1.2剪股颖粒线虫形态鉴定特征
9.1.2.1雌虫：虫体租壮，经热杀死后向腹面卷曲成螺旋形，角质膜表面环纹细在成虫的虫体上难于
观察到侧带区.唇区低平，缩.垫刃型食道，食道前体部圆柱形，中部略膨大，与中食道球连接处稍
缩：狭部短而窄；后食道腺发达，剩形，不呈明显耳叶状，不覆盖肠的前端或稍覆盖.前生殖腺发达，卵巢常折叠2次，卵母细胞围绕一中柱轴状多行排列，受精囊长梨形，与输卵管连接处稍缩分开，子宫内常有多个卵同时存在.后阴子宫囊的长度为肛阴距的一半，内充满精子.尾锥形，尾端锐尖.
9.1.2.2雄虫：虫体比雌虫短而细，经热杀死后一般呈弓形.精巢常回折1次，精母细胞多行排列.交合刺比小麦粒线虫A.tririci的纤细，近端部向腹面折或不折，引带细线形.交合伞亚端生.尾端锐尖.9.1.2.32龄幼虫：除生殖系统未发育及虫体较小外，其余形态结构与成虫相似.
9.1.2.4近似种：小麦粒线虫A.rrizici.两者的区别是：小麦粒线虫尾端钝圆，交合刺中部明显增租，头状突不腹折或略腹折，引带细线状，寄生牧草. 基端头状突腹折，引带槽状，寄生小麦和燕麦；而剪股额粒线虫则是尾端尖，交合刺中部仅略增粗，基端
9.1.3剪股颖粒线虫形态特征图
参见附录B.
9.1.4剪股颖粒线虫测计值
见表1.
表1剪股颖粒线虫形态测量数据
测量项目 和参数 雌虫 股颖分高物 维虫 雌虫 早熟禾和假梯草分高物 雄虫L/mm 1. 39 2. 60 1 05~1 45 0 55~0 82 2静幼虫 2. 52 ~4. 14 1. 54 ~2. 31 0 81~1. 25 2龄幼虫13 8~25 4 23 8~30. 0 47. 2~65. 0 21 8~30. 7 21 6~34.4 43. 5~~71 012 6-28 7 6. 5~8 9 3. 2~4 5 10. 3 ~26. 5 6 8~11. 6 4. 0~6 125 2~43 0 21. 5~28. 4 11. 7~20. 0 28 8~~48. 9 20 4~32. 7 12. 1~15. 487-92 26~06针/μm 10~12 10~12 10 10~12 10~12 10交合刺/m 25~32 30~37引带/m 10~13 13~15注：L：线虫体长；a：体长/最大体宽；b：体长/虫体前端至食道腺与肠连接处的距离；r：体长/尾长： V:虫体前端至阴门的距离×100/体长.
9.2分子生物学检测
见附录C.
10结果判定
异引物扩增获得的 PCR产物约为500bp.同时阳性对照的 PCR产物约为500 bp，空白对照无PCR产物 符合9.1形态特征的粒线虫成虫，可判定为剪股颖粒线虫；符合9.1形态特征的粒线虫幼虫，经9.2特时，也可判定待检线虫为剪股颖粒线虫.
