中华人民共和国国家标准
GB/T31800-2015
Detection and identification of Plum pox virus
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草.本标准起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口.局、中国检验检疫科学研究院.本标准主要起草人：陈先锋、张慧丽、陈定虎、张吉红、徐瑛、郭立新、闻伟刚、杨红霞、杜洪忠、吴品珊.
李痘病毒检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了李痘病毒的免疫学和分子生物学检疫鉴定方法. 本标准适用于植物材料，包括无性繁殖材料、组培苗、种子、花和果实中李痘病毒的检疫鉴定.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T6682分析试验室用水规格和试验方法SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法
3仪器设备和主要试剂
3.1仪器设备
普通PCR仪、实时荧光PCR仪、酶标仪、电子天平（1/1000g）、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、水浴锅、台式高速冷冻离心机、一80C超低湿冰箱、超净工作台、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、涡旋振荡器.可调式微量移液器（2L、10L.100L200yL、1000yL、500L）及相应的无RNase吸头、无RNase离心管、PCR管和研钵等.
3.2主要试剂
除特别规定外，实验用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定.
TagDNA聚合酶、SYBRgreen1、DNA相对分子质量标准物、溴化乙锭、琼脂糖、溴酚蓝等.双抗体酶 Trizol、焦碳酸二乙酯（DEPC）、液氮、三氯甲烷、异丙醇、乙醇、β-疏基乙醇、RNA反转录酶、联免疫吸附测定方法（DAS-ELISA）检测试剂配制方法见附录B中B.1.
4检疫鉴定方法
4.1症状检查
见附录A），可采集表现症状的花、叶片或果实进行后续检测. 仔细检查植株的叶片及花、果实、果核是否有褪色、环斑、畸形等可疑症状，如果出现了典型症状（参
4.2双抗体酶联免疫吸附测定方法（DAS-ELISA）
DAS-ELISA具体操作步骤见附录B.
4.3普通RT-PCR检测方法
普通RT-PCR检测方法具体操作步骤见附录C.
GB/T 31800-2015
4.4实时荧光RT-PCR检测方法
实时荧光RT-PCR检测方法具体操作步骤见附录D.
4.5免疫电子显微镜观察
按 SN/T 1840执行.
4.6株系鉴定
在检出李痘病毒时必要时可对其进行株系鉴定株系鉴定的具体操作步骤见附录E.
5结果判定
RT-PCR方法或实时荧光RT-PCR方法进行验证，当验证结果也为阳性时，则判定检出李痘病毒.若需 采用DAS-ELISA进行初筛，测定结果为阴性，判定未检出李痘病毒：测定结果为阳性，用普通进一步鉴定该病毒，可采用免疫电子显微镜观察或PCR产物序列测定等进行复验.
6样品保存与结果记录
6.1样品保存
经检验确定携带李痘病毒的样品，经登记和标记后保存在一20C冰箱中，有条件的保存在一80C冰箱中，妥善保存6个月，以备复核.
6.2结果记录
需要保存的记录包括：样品的种类、自然状态、来源、为害症状及为害程度（无症状也要说明），诊断时使用的方法（包括质控物质，以及每种方法获得的结果），酶联免疫吸附测定法检测应有酶联板反应的数值，RT-PCR检测应有电泳结果照片，实时荧光RT-PCR应有扩增曲线图片，鉴定实验室的名称，负责人和鉴定人的签字等.
A.1李痘病毒基本信息
中文名：李痘病毒学名：Plum pox virus异名：Sharka virus缩写：PPV分类地位：马铃薯Y病毒科（Potyviridae），马铃薯Y病毒属（Potyvirus）.
A.2方法原理
强，可以制备病毒抗血清和外壳蛋白基因保守性强，可以设计特异性引物和探针，采用双抗体夹心酶联 李痘病毒为害症状、血清学特性和基因组特征是制定本标准的主要依据.根据李痘病毒免疫原性免疫吸附反应和逆转录-聚合酶链式反应以及序列测定作为该病毒的检疫鉴定依据.
A.3寄主范围
PPV能侵染木本科和草本科寄主，自然条件下，PPV很容易侵染李属植物：杏（Prumsarmeniaca）桃（P.perxica）、油桃（P.persica var. nectarina）欧洲李（P.domestica ）李（P，salicina）乌荆子李（P.insitiria）、樱桃李（P.cerasifera）、麦李（P.glandulasa）、甜樱桃（P.auiam）、欧洲酸樱桃（P.cerasus）.野生的李属寄主：扁桃（P.amygdaius）、杏（P.americana）、西沙樱桃（P.bessey）、马哈 利樱桃（P.mahaleb）、梅（P.mume）、矮樱桃（P.pamila）、郝图兰李（P.hortulana）、山桃（P.davi-dana）、毛樱桃（P.tomentosa）、紫杏（P.nigra）滨梅（P.marizime）、桂樱（P.laurocerasus）.
A.4病害症状
PPV在植株的叶片、花瓣、果实和果核都可能引起症状.
叶片：叶上症状特别清晰，出现带状或环状褪绿斑，明脉甚至畸形，见图A.1a、b、c.
花瓣：引起花瓣褪色，见图A.1d
环内形成褐色或坏死区域，果实内部变褐见图A.1i. 果实：果皮上出现褪绿或环斑，见图A.1e、f、g-果实受害后有时会变形，呈不规则状并在其褪色
果核：染病的果核上产生浅色的环斑，见图A.1h.
