中华人民共和国国家标准
GB/T32131-2015
辣根过氧化物酶活性检测方法 比色法
Determination of the activity of horse radish peroxidase-Colorimetric method
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草.
本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口.
本标准起草单位：深圳市计量质量检测研究院、中国测试技术研究院、四川省出人境检验检疫局、珠海出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：额心田、张世伟、唐栋、周李华、胡科新、洪晓明、严琼英、刘斌、樊学军、杨泽、杨国武.
辣根过氧化物酶活性检测方法比色法
1范围
本标准规定了辣根过氧化物酶活性检测方法，本标准适用于生化试剂、工业产品中辣根过氧化物酶活性的测定，
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3.1
酶活性单位activityunit
在25℃，pH7.0时，每分钟催化转化一个微摩尔过氧化氢的酶量.
4原理
辣根过氧化物酶能迅速催化过氧化氢氧化愈创木酚（又名邻甲氧基苯酚，化学式：CHO）生成棕色的四邻甲氧基连酚，通过436nm处吸光度值的变化计算其酶活力.
反应式为：
四邻甲氧基连酚
5仪器设备及器具
5.1pH计5.3紫外-可见分光光度计.
5.2分析天平：感量0.0001g-
5.41cm比色Ⅲ，
6试剂
6.10.1mol/L磷酸二氢钠称取NaH:PO2H:O 15.6g（或NaH:POH:O 13.8g）加蒸馏水至1 000mL溶解.6.20.1mol/L磷酸氢二钠馏水至1000mL溶解. 称取NaHPO12H;O 35.816 g(或Na:HPO 7HO 26.8g或NaHPO2HO 17.8g）加蒸6.3A液：0.1mol/LpH7.0磷酸盐缓冲液.由38mL按6.1条配制的0.1mol/1磷酸二氢钠，62mL按6.2配制的0.1mol/L磷酸氢二钠，加蒸馏水定容至100mL磷酸盐缓冲液（pH7.0）.6.4B液：20mmol/1愈创木酚水溶液.由0.22mL愈创木酚用蒸馏水定容至100ml.6.6蒸馏水：二重石英蒸馏水. 6.5C液：8mmol/1过氧化氢水溶液.由0.082mL30%过氧化氢用蒸馏水定容至100ml.
7分析步骤
7.1固体样品待测酶液的制备
称取酶粉0.1g.精确至0.0001g，加人10mLA液溶解，再用A液稀释至适宜浓度（见7.3）.
7.2液体样品待测酶液的制备
吸取液体酶1mL 用A液稀释至适宜浓度（见7.3）.
7.3测定
所用试剂及样品溶液测定前于25C士2℃恒温箱中孵育30min.
于1cm比色m中，按次序加人2.8mLA液，0.1mLB液，0.05mLC液和0.05ml蒸馏水作为参比溶液.于另只1cm比色Ⅲ中，按次序加入2.8mLA液，0.1mL B液，0.05mLC液和0.05mL酶液.快速混匀后，于分光光度计436nm波长下，测定初始时和2min后的吸光度值，两者之差即为△A （△A的值在0.080~0.400之间方为有效，如大于0.4应调整稀释度）.每次测定至少完成2个平行实验，
8结果计算
8.1液体样品酶活力U按式（1)计算：
..( 1 )
式中：
U液体样品酶活力.单位为毫升（mL）：△A-样品吸光度变化值；3.0一反应试剂的总体积，单位为毫升（mL）；D 稀释倍数； 四邻甲氧基连酚换算成过氧化氢的量的系数：25.5-四邻甲氧基连酚的摩尔消光系数，单位为升每摩尔厘米[L/（molcm）]；
比色Ⅲ光径，单位为厘米（cm）；0.05一参与反应酶液的体积，单位为毫升（mL）： -反应时间，单位为分（min）.2
计算结果保留三位有效数字.
8.2固体样品酶活力U按式（2）计算：
U = A×3.0×4×D ×1 000 (2)25.5×1×0.05×2
式中：
U 固体样品酶活力，单位为克（g）；4 样品吸光度变化值：3.0 反应试剂的总体积，单位为毫升（mL）；4 D 四邻甲氧基连酚换算成过氧化氢的量的系数； 稀释倍数：25.5 四邻甲氧基连酚的摩尔消光系数，单位为升每摩尔厘米[L/（molcm）]；1 比色Ⅲ光径，单位为厘米（cm）；0.05 参与反应酶液的体积，单位为毫升（mL）；2 反应时间，单位为分（min）； 称取酶粉的质量，单位为克（g）；溶解酶粉的液体体积，单位为毫升（mL）.计算结果保留三位有效数字.
9精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算数平均值的10%.
