中华人民共和国国家标准
GB/T 33526-2017
Genetically modified organism detection method by digital PCR
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口.
本标准主要起草单位：中国检验检疫科学研究院、广西出人境检验检疫局检验检疫技术中心、中国农业大学、中国农业科学院油菜作物研究所.
本标准主要起草人：付伟、杜智欣、王勤、王慧煜、许文涛、吴刚、朱水芳、刘晓飞.
转基因植物产品数字PCR检测方法
1范围
本标准规定了转基因成分检测的数字PCR方法.
本标准适用于玉米、大豆、油菜、水稻、马铃薯、百稽、棉花等转基因植物及其产品的转基因成分数字PCR检测.
本标准所能达到的检测低限为0.1%（质量分数）.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3.1 18srRNA 基因18srRNA gene
转录自18srDNA，是细胞核糖体的组分之一.
CaMV35s启动子基因CaMV35spromotor
来自花椰菜花叶病毒（Cauliflower mosaic virus，CaMV）的35s启动子.
NOS终止子基因NOS terminitor
来自胭脂碱合成酶基因NOS的终止子.
4原理
数字PCR其技术原理是通过将原始PCR反应体系进行分制，进而对小的反应体系进行扩增并后续检测.通过对反应体系进行有限的分割，从而使整个反应体系可以更加耐受核酸抑制因子，并且更加稳定、准确、快速地对痕量的转基因成分进行精准鉴定.
现阶段数字PCR的实现形式包括芯片式数字PCR与微滴式数字PCR两种.其中芯片式数字PCR通过微流控芯片实现对原始反应体系的分割，这种分制方式具有稳定性好、均一性好的优点，但是这种分割方式的实验成本相对较高：微滴式数字PCR平台通过产生微小油包水体系实现反应体系的分
割.这种分割方式具有反应速度快，分割成本低的优点，但是相对来说，这种分制方法的稳定性较差，而且对于数据分析的要求也相对较高.由于数字PCR的平台差异，对不同数字PCR平台进行的数据协同分析也成为了目前数字PCR检测方法发展的关键.
本标准针对通用筛选元件CaMV35s启动子和NOS终止子设计选取特异性引物和探针进行数字PCR扩增，并根据扩增结果来判定CaMV35s启动子和NOS终止子的外源筛选元件成分.另外，通过芯片式数字PCR和微滴式数字PCR的协同比对，本标准方法可以在两种平台中达到同样的检测目的.
5试剂与材料
除非有特殊说明，仅使用分析纯试剂和符合GB/T6682规定的一级水.
5.1DNA提取试剂盒
推荐针对不同的样品基质类型选取不同的基因组提取试剂盒.
5.2数字PCR反应试剂盒
推荐按照不同的数字PCR平台的说明书选取其推荐的数字PCR反应试剂盒.
5.318srRNA基因引物和探针
18s-F:5'-CCTGAGAAACGGCTACCAT-3′18s-R:5'-CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3′18s-P:5'-VIC-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-BHQ1-3
5.4CaMV35s启动子基因引l物和探针
p35s-F:5'- ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT-3′p35s-P;5'-VIC- CCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCT-BHQ1-3 p35s-R;5′- CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT-3
5.5NOS终止子基因引物和探针
TNOS-F:5'-ATCGTTCAAACATTTGGCA-3'TNOS-R:5'-ATTGCGGGACTCTAATCATA-3'TNOS-P;5'-VIC-CATCGCAAGACCGGCAACAGG-BHQ1-3'
6仪器与设备
6.1分析天平：感量0.1mg.6.2生物安全柜. 6.3数字PCR扩增仪.6.4纯水仪.6.5核酸定量仪.6.6涡旋震荡仪.6.7其他相关仪器和设备. 6.8离心管.2
6.9不同量程移液器以及配套吸头如下：
b）量程为0.5μL~10μL和0.1μL~2.5pL的移液器以及配套的10μL吸头.
7操作步骤
7.1抽样
按照GB/T19495.1和GB/T19495.7的规定执行.
7.2制样
按照GB/T 19495.1和 GB/T 19495.7 的规定执行.
7.3试样预处理
按照GB/T19495.1和GB/T 19495.3的规定执行.
7.4DNA模板制备
按照GB/T19495.1和GB/T19495.3的规定执行.
7.5数字PCR扩增方法
7.5.1试样数字PCR反应
7.5.1.1内标准基因数字PCR反应
每个试样内标准基因数字PCR反应设置3个平行.并按照表1的组分和终浓度配置数字PCR反应体系，反应体系配置完成后，进行反应体系的分割，其中芯片法数字PCR通过微流控芯片实现本步进行操作.数字PCR反应的有效分割体系数不得低于理论分割体系数的60%.
表1数字PCR反应体系
试剂 终浓度 体系2×反应Mix 1x 2 xL20 μmol/IL zSSIIb-F/p35s-F/ TNOS-F 0.45 μmol/1L. 0 09 ycl.20 μmol/L zSSIIb-R/p35sR/ TNS-R 0 45 μmol/1. 0 09 pcl.20 μmol/IL zSSIIb-P/p35s-P/ TNOS-P 0.1 μmol/L 0 02 ypL50 ng/pl DNA 模板 12 5 ng/xL I pL.水 补齐 4 pL总体系 4 pl推荐市面上现售的数字PCR平台进行实验，并针对市面上现售的不同数字PCR平台依据说明书调整反应体系的组分和最终体积，并保证表中所列组分的终浓度不变.
