中华人民共和国国家标准
GB/T34408-2017
Detection of bovine ovine and porcine derived materials in leatherby qualitative polymerase chain reaction （PCR）method
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由全国质量监管重点产品检验方法标准化技术委员会（SAC/TC374）提出并归口.
京）质检技术研究院有限公司、陕西科技大学、中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室、国家 本标准起草单位：广州质量监督检测研究院、中检华纳（北京）质量技术中心有限公司、中检联盟（北皮革制品质量监督检验中心（广州）
本标准主要起草人：陈宗良、黄巧娟、覃芳芳、罗海英、周惠、郭燕华、屈良鸽、黄宇锋、王学川、柯振华、吴玉銮、孙世或.
天然皮革牛、羊、猪源性成分定性 PCR检测方法
1范围
本标准规定了天然皮革中水牛、黄牛、山羊、绵羊和猪源性成分的聚合酶链式反应（PCR）检测方法.本标准适用于水牛、黄牛、山羊、绵羊和猪皮革动物源性成分的定性检测. 本标准不适用于再生革和浸渍水解胶原的人造革（合成革）等材料的检测.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T21101-2007动物源性饲料中猪源性成分定性检测方法PCR方法 GB/T20190-2006饲料中牛羊源性成分的定性检测定性聚合酶链式反应（PCR）法
3原理
通过PCR扩增，获得目标物种的基因序列根据扩增结果判断皮革所含动物源性成分. 提取天然皮革样品的脱氧核糖核酸（DNA）针对牛、羊、猪物种特异性的内源基因序列设计引物，
4试剂和材料
4.1所用试剂除特殊指明外，均为分析纯，用水均为GB/T6682中规定一级水.4.2灭菌水，4.3低亚硫酸钠.4.4三羟甲基氨基甲烷（Tris）.4.6乙二胺四乙酸钠盐（EDTA-2Na). 4.5氢氧化钠（NaOH）.4.7十二烷基硫酸钠（SDS）.4.8乙酸钠.4.9氯化钠.4.10琼脂糖. 4.11苯酚（Tris平衡酚）.4.12三氯甲烷.4.13冰乙酸.4.14无水乙醇， 4.15异戊醇.
4.16异丙醇.4.17盐酸.4.18氨水（25%）.4.1975%乙醇溶液：取75mL无水乙醇，加水定容至100mL.4.20 三氯甲烷：异戌醇=2411（体积比）.4.21蛋白酶K（20mg/mL），-20C保存. 4.22澳化乙锭（10mg/mL）或等效商业化的其他染料.4.232%（质量浓度）低亚硫酸钠溶液：称取2g低亚硫酸钠，溶于100mL水中.4.241mol/LTris-HCl缓冲液（pH7.6和pH8.0)：称取121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris)，溶于800mL水中，冷却至室湿用盐酸调节pH至所需值加水定容至1L，高压灭菌.至8.0，溶解后加水定容至1L，高压灭菌.4.265mol/L氢氧化钠溶液：称取40g氢氧化钠溶于100mL水中，冷却后，加水定容至200mL.4.275mol/L氯化钠溶液：称取58.44g氯化钠溶于100mL水中，加水定容至200mL.4.283mol/L乙酸钠溶液：称取49.21g乙酸钠，溶于120mL水中，用冰乙酸调节pH至5.2，加水定4.29SDS裂解缓冲液：在500ml水中加人100mL 1mol/LTris-HC1缓冲液（pH7.6），100mL 容至200mL高压灭菌0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶液，100mL5mol/L氯化钠溶液，5gSDS，完全溶解，加水定容至1L，高压灭菌.4.30TE缓冲液：在800mL水中加人10mL1mol/LTris-HC1(pH 8.0）缓冲液，2mL0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶液，加水定容至1L，高压灭菌.4.311×TAE电泳缓冲液：取50×TAE（242 g Tris 57.1 mL 冰乙酸，100mL 0.5 mol/L EDTA溶 液，定容至1L)按比例稀释.4.32上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%（质量浓度）蔗糖溶液，或等效商品化试剂.4.33DNA吸附柱：推荐使用Qiagen品牌DNA吸附柱，也可以使用等效DNA吸附柱.4.34DNA提取试剂盒.4.36PCR试剂盒，包括Tag酶、dNTPs、PCR体系缓冲液等，按试剂盒要求保存. 4.35PCR产物回收试剂盒.4.37DNA分子量标准品（100bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp等).4.38牛、羊、猪基因组DNA，4C保存.4.39引物：所需引物信息见表1，-20C保存.
表1引物信息
引物名称 引物序列 PCR产物大小/bp 目标基因 适用范围iE =5′-AAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTT -3’ 内参基因（线粒内参引物 反 =5′-GATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTA-3' 240 体16S RNA基因 哺乳动物皮革牛特异性 E =5-GCCATATACTCTCCTTGGTGACA-3′引物” 反;5′-GTAGGCTTGGGAATAGTACGA-3′ 271 牛内源基因 牛皮革山羊特异性 E=5′-TATTAGGCCTCCCCCTTGTT-3 293 山羊内源基因 山羊皮革引物 反=5′-CCCTGCTCATAAGGGAATAGCC-3
表1（续）
引物名称 引物序列 PCR产物大小/bp 目标基因 适用范围绵羊特异 IE :5'-CCTCCAACAGTGAATACTT-3'性引物 反：5'-TCCTCCTCATAAAGGAATGGCC-3′ 202 绵羊内源基因 绵羊皮革猪特异性 IE :5'-GCCTAAATCTCCCCTCAATGGTA-3 212 猪内源基国 猪皮革引物 反：5'-ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG -3该引物来源于GB/T20190-2006. 该引物来谦于GB/T 20190-2006该引物来源于GB/T21101-2007
5仪器与设备
5.1分析天平：精度±0.01g.5.2pH计：精度±0.1.5.3 高压灭菌锅.5.4 恒温水浴箱. 剪刀.5.5 5.6 涡旋震荡器.5.7 高速冷冻离心机.5.8 微量可调移液器;0.1 μL~2.5 μL，1 pL~10μL 2μL~20 pL 20 μL~200 μL 100 μL~1 000μL.5.10 5.9 超微量核酸蛋白分析仪. 超净工作台.5.11PCR热循环仪，5.12 电泳仪5.14全自动核酸电泳分析仪， 5.13凝胶成像系统，
6检测步骤
6.1脱色
热至65℃.取2块~3块约5cm×5cm试样放入烧杯中，试样应完全浸没在溶液中，边摇晃边滴入氮 深色皮革样品宜预先在通风厨中进行脱色处理.将2%低亚硫酸钠溶液（4.23）加人烧杯中，水浴加水（4.18），每100mL溶液加入1mL氨水，65C水溶0.5h~2h，期间摇晃数次，直至试样明显脱色.自来水冲洗干净，晾干待用.
6.2DNA提取
6.2.1试样DNA提取
a）将经脱色（6.1）处理或未经脱色处理的样品剪碎至小于2mm×2mm，称取1g~2g试样，放 试样DNA提取步骤如下：
