中华人民共和国国家标准
农业农村部公告第1012号-15-2026
转基因植物及其产品成分检测 耐除草剂棉花KJC017转化 体特异性PCR方法
Detection of geneticallymodified plants and derived productsEvent-specificPCRmethod forherbicide-tolerant cottonKJC017
中华人民共和国农业农村部发布
前言
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由中华人民共和国农业农村部提出.
本文件由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归口.
本文件起草单位：农业农村部科技发展中心、深圳市农产品质量安全检验检测中心、科稷达隆（北京）生物技术有限公司.
本文件主要起草人：李日清、董玉风、徐利群、陈子晟、董秋平、刘晋、王冬梅、罗燕、李筠、莫洁华、刘敏、杨宝丽、裴欣瑶、孙宇.
转基因植物及其产品成分检测 耐除草剂棉花KJC017转化体特异性PCR方法
1范围
本文件规定了耐除草剂棉花KJC017转化体特异性PCR定性和定量检测方法.本文件适用于棉花及制品中KJC017转化体成分的定性和定量检测.
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用面构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
农业部1485号公告4-2010转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化农业部1943号公告-1-2013转基因植物及其产品成分检测棉花内标准基因定性PCR方法NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求
3术语和定义
农业部2031号公告8-2013界定的以及下列术语和定义适用于本文件.
3.1
耐除草剂棉花KJC017转化体特异性序列event-specific sequence of herbicide-tolerant cotton KJC017
耐除草剂棉花KJC017转化体的外源插入片段5'端或（和）3'端与棉花基因组的连接区序列，包括棉花基因组部分序列及转化载体T-DNA部分序列.
3.2
阳性质控品positive control
用于质量控制的阳性样品，分为用于定性检测的阳性定性质控品和用于定量检测的阳性定量质控品.注：阳性质控品宜优先选用有证标准物质也可使用经验证的实验室配制样品.阳性定性质控品的转基因含量为0.1%~1.0%，阳性定量质控品的转基因含量宜与标识网值相当.
校准品calibrator
用于绘制标准曲线的梯度稀释样品，用纯合转化体基因组DNA或转基因含量较高的有证标准物质或阳性样品的DNA稀释制备，确认后至少含5个有效浓度，宜优先选用有证标准物质.
3. 4
子样subsample
试样预处理后，从同一试样不同位置随机抽取的独立样品.
3.5
C值ACr value
实时荧光PCR扩增中样品转化体特异性序列平均C值与内标准基因平均C值的差值，
AACr值AACt value
实时荧光PCR扩增中试样的△C:值与阳性定量质控品的△C值的差值.
4通用要求
4.1检测方法
一）、实时荧光PCR定量检测方法（方法二）、普通PCR定性检测方法（方法三）3种方法，可根据实际检测 第5章至第7章分别规定了耐除草剂棉花KJC017转化体成分的实时荧光PCR定性检测方法（方法需求选用.
4.2试剂、材料、模板
第5章至第7章规定的3种不同方法间的试剂、材料、试样模板、质控品模板，在满足检测条件的情况下可以通用.
5实时荧光PCR定性检测方法（方法一）
5.1原理
KJC017转化体成分.若试样中含有耐除草剂棉花KJC017转化体成分，计算试样与阳性定量质控品的 实时荧光PCR扩增.依据是否扩增获得预期的典型扩增曲线，判断试样中是否含有耐除草剂棉花△C值，判定试样与阳性定量质控品相比转化体成分含量的高低.
5.2试剂和材料
除非另有说明，仅使用分析纯试剂、蒸馏水或以上等级的水.5.2.1DNA提取试剂盒.5.2.2PCR扩增试剂：Tag DNA聚合酶、PCR扩增缓冲液、25mmol/1.氯化镁（MgCl）溶液、dNTPs溶 液（浓度为10mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP4种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合）.
注：若不采用上述PCR扩增试剂，也可选用实时荧光PCR试剂盒.
5.2.3棉花内标准基因ACPI基因引物/探针
ACP-qF;5'-ATTGTGATGGGACTTGAGGAAGA-3';ACP-qR:5′-CTTGAACAGTTGTGATGGATTGTG-3′; ACP-qP:5'-ATTGTCCTCTTCCACCGTGATTCCGAA-3'.注1：预期扩增片段大小为76bp.注2：ACP-P为ACP1基因的TaqMan探针，其5'端标记荧光报告基团（如 FAMHEX等），3端标记对应的荧光锌灭[来源：农业部1943号公告-1-2013] 基团(如 TAMRA、BHQ1 等）.
5.2.4耐除草剂棉花KJC017转化体特异性序列引物/探针
KJC017-qF:5'-TGTTGAGGCTTTGGACTGAGAA-3′ ;KJC017-qR :5'-TTGGTCATGGTGGTTAATATGAGAA-3′:注1：预期增片段大小为123 bp（见附录A中的A.1). KJC017-qP:5'-TGCTAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAG-3′.注2：KJC017-qP为耐除草别棉花KJCo17转化体特异性序列的TagMan探针.其5'端标记荧光报告基团（如 FAM、
）
5.2.510mol/1氢氧化钠（NaOH）溶液：在160ml水中加人80.Og氢氧化钠，溶解后，冷却至室湿，再加水定容至200mL.
5.2.6500mmol/1乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na）溶液（pH8.0)：称取18.6g乙二胺四乙酸二钠，加人70mL水中，缓慢滴加氢氧化钠溶液（见5.2.5）直至乙二胺四乙酸二钠完全溶解，用氢氧化钠溶液（见5.2.5）调pH至8 0，加水定容至100mL.在103.4kPa（121℃C）条件下灭菌20min.
5.2.71mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HC1)溶液（pH8.0)：称取121.1g三羟甲基氨基甲烷溶解于800mL水中，用盐酸（HCI）调pH至8.0，加水定容至1000mL.在103.4kPa（121C）条件下灭菌2
