中华人民共和国水产行业标准
SC/T7249-2025
大口黑鲈蛙病毒检测方法
Detection methods for largemouthbass ranavirus
前言
本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由农业农村部渔业渔政管理局提出.
本文件由全国水产标准化技术委员会水产养殖病害防治分技术委员会（SAC/TC156/SC11）归口.
本文件起草单位：浙江省淡水水产研究所、全国水产技术推广总站、华东理工大学、中国检验检疫科学研究院、浙江省水产技术推广总站.
本文件主要起草人：潘晓艺、菌凌云、张翔、陈静、蔡晨旭、沈锦玉、王启要、王娜、姚嘉赞、朱凝瑜、袁雪梅、黄雷、彭先启、步夏莲、黄小红、尹文林、梁倩蓉.
大口黑鲈蛙病毒检测方法
1范围
本文件描述了大口黑鲈蛙病毒检测的试剂和材料、仪器设备、主要临床症状、样品、病毒分离、套式PCR检测、qPCR检测及综合判定的方法.
本文件适用于大口黑鲈蛙病毒的检测，及其引起相关疾病的流行病学调查、检疫和监测.
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用面构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T18088出入境动物检疫采样SC/T7016.1鱼类细胞系第1部分：胖头鱼岁肌肉细胞系（FHM）SC/T7016.5鱼类细胞系第5部分：鲤上皮瘤细胞系（EPC） SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范
3术语和定义
SC/T7011.1和SC/T7011.2界定的术语和定义适用于本文件.
4缩略语
下列缩略语适用于本文件.BHQ：黑洞淬灭剂(black hole quencher)bp:碱基对(base pair)CPE：细胞病变效应（cytopathic effect） Ct:阔值循环数（cycle-threshold）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid)dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸混合物（deoxy-ribonucleoside triphosphate mixture)EDTA;乙二胺四乙酸(ethylenediarminetetraacetic acid)FHM：胖头鱼岁肌肉细胞系(fathead minnow muscle cell line) EPC;狸上皮瘤细胞系(epithelioma papulosum cyprini celI line)LMBV：大口黑鲈蛙病毒（largemouth bass ranavirus)M199:培养液199(medium 199)PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）SDS：十二烷基硫酸钠（sodium dodecy] sulfate) qPCR：实时荧光定量 PCR(quantitative real-time PCR)Taq：水生栖热菌（Thermus aquaticus）TE:Tris 盐酸和 EDTA(Tris HCI-EDTA)Tris：三羟甲基氨基甲烷（tris hydroxymethyl aminomethane)6-FAM:6-俊基荧光素（6-fluorescein amidite)
5试剂和材料
5.1Tris 饱和酚（pH≥7.8）. 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水.5.2无水乙醇，5.3TaqDNA聚合酶（5U/pL)：商品化试剂，20C保存.5.4Hot-Stari Tag DNA聚合酶（5 U/gL）：商品化试剂，-20C保存.5.5dNTPs（各2.5mmol/L）：商品化试剂，-20C保存.5.610×PCR缓冲液（无Mg2）：商品化试剂，20C保存.5.7MgCl2（25mmol/L）：商品化试剂，-20C保存. 5.8DNA Marker:相对分子质量大小在100 bp~2 000bp范围商品化试剂，-20℃C保存.5.96×载样缓冲液：商品化试剂，4C保存.5.10核酸染料：商品化试剂，4C保存.5.11鲤上皮瘤细胞系（EPC）：符合SC/T7016.5的规定.5.12胖头鱼岁肌肉细胞系（FHM）：符合SC/T7016.1的规定.5.13孵育液：含有1000IU/mL青霉素和1000xg/mL链霉素的M199培养液，4“C保存.5.14维持液：含有2%新生牛血清的M199培养液，4C保存.5.16氯伤/异戊醇混合液：将氯仿、异戊醇按体积比24：1混匀，4C保存. 5.15酚/氯仿/异戊醇混合液：将Tris饱和酚、氯仿、异戊醇按体积比25：24：1混匀，4C保存.5.17TE缓冲液：按附录A中A.1的要求配制.5.18抽提缓冲液：按A.2的要求配制.5.19蛋白酶K按A.3的要求配制.5.2010mol/1.乙酸铵：按A.4的要求配制.5.2150×电泳缓冲液：按A.5的要求配制.5.221X电泳缓冲液：按A.6的要求配制.5.23套式PCR引物：10μmol/L，20C保存.其中，第一步PCR引物F1和R1，扩增967 bp片段；第 二步PCR引物F2和R2，扩增475bp片段（见附录B），引物序列如下：物 F1;5'-TCTCGCCACTTATGACAGCCTT-3':引物 R1;5′-GGGCTCCAGGACGGTGTTAC-3';引物 F2:5'TATGTGCTCAACTCTTGGCTGGTC-3';5.24qPCR引物：10pmol/L，-20℃保存.扩增引物分别为LMBVq102F和LMBVq102R，探针为 引物R2：5′-CCACGATKGGCTTGACTTCTCC-3K为简并碱基（K：G/T).LMBVqTP 扩增LMBV MCP基因中的102bp片段（见附录B），引物探针序列如下：LMBVq102F:5'ACTGGCCACCACCTCTACTC-3';LMBVq102R:5'-AGACACGTTGATGCTTGCGT-3′:5.25阳性对照：感染LMBV的细胞悬液或组织匀浆液，80C保存. LMBVqTP:6-FAM-ACGCCCTGAGCCTCAACGATCC-BHQ1.5.26阴性对照：未感染LMBV的细胞悬液或组织匀浆液，一80℃C保存.5.27空白对照：燕馏水.
6仪器设备
6.1组织研磨器. 2
