中华人民共和国国家标准
GB/T 35538-2017
Technical guides for industrial enzyme preparations assay
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草
本标准由全国食品工业标准化技术委员会（SAC/TC64）提出.
本标准由全国食品工业标准化技术委员会工业发酵分技术委员会（SAC/TC64/SC5）归口.
限公司、青岛蔚蓝生物集团有限公司、诺维信（中国）投资有限公司. 本标准起草单位：中国食品发酵工业研究院、浙江艾杰斯生物科技有限公司、山东隆科特酶制剂有
本标准主要起草人：张蔚、田亚琼、刘明、滕智津、武竹英、李聪、霍文景、张世童、潘宏涛、郭庆文、陈亮珍.
工业用酶制剂测定技术导则
1范围
施与评价等要求. 本标准规定了工业用酶制剂的术语和定义、理化指标分类、酶活力测定导则及酶活力测定方法的实
本标准适用于工业用酶制剂产品关键测定指标测定方法的建立、实施及评价的指导.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
QB/T1803工业酶制剂通用试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3.1
酶制剂enzyme preparation
菌、放线菌、真菌菌种）发酵、提取制得，具有特殊催化功能的生物制品.
由动物或植物的可食或非可食部分直接提取，或由传统或通过基因修饰的微生物（包括但不限于细
注：商品化的工业用酶制剂产品允许加人易于产品肥存、使用的配料成分.
3.2
酶活力enzyme activity
酶在一定条件下催化某一特定反应的能力.
4工业用酶制剂理化指标分类
4.1工业用酶制剂测定关键性指标：酵活力.
4.2工业用酵制剂测定通用性指标如下：
b）细度； a）容重；c)pH.
4.3其他指标.
5工业用酶制剂酶活力测定方法建立指导
5.1酶活力测定反应条件关键因素的选择确立指导
5.1.1底物的选择底物的选择方法如下：
一专一性不强的酶，可作用于多种底物时，在多种底物中，选择米氏常数K，最小的底物： 应对可用的底物做筛选：专一性较强的酶，选择该酶的专一性催化底物；一根据检测仪器和实际检测条件，选择便于检测的底物或产物：一选择合适的底物浓度（一般控制在米氏常数K的20倍～100倍，在实际工作考虑到底物溶 解度的限制，价格因素，可将底物浓度降为K.的10倍）.
示例1：
蛋白酶：以酪蛋白作为底物.酪蛋白是确乳类动物乳计的主要成分，以大分子蛋白作为底物，可以准确反映蛋白酶的留化性能和活力.
示例2：
腊肪酶：以甘油三丁酸酯作为底物，基于酸斌滴定的原理建立检测方法.虽然脂肪酶种类繁多，但由于该类酶多属于非专一性翟化，以甘油三丁酸酯作为底物能反映绝大多数脂肪酶的活性.
示例3；
纤维素酶：以羟甲基纤维素（CMC）作为底物检测还原期产物在一定时间内的增量：或者用黏度法，以一定时间内的纤维素滤纸为底物，测定纤维素酶对滤纸的降解能力. 反应体系中黏度的降低反映底物的降解程度，从而获得纤维素酶的活力，此外，还可以测定酶的滤纸酶活力，即以特定
示例4：
α-淀粉酶：选择淀粉作为底物，用碘试剂检测淀粉被降解的程度反映淀粉酶的活力：或者采用亚乙基-G7-PNP作为底物，α-淀粉酶与α-葡萄糖甘酶共同作用将该底物水解释放黄色的p-硝基苯酚，利用全自动生化分析仪进行检测.
5.1.2温度的选择
温度的选择方法如下：
一根据酶的种类，预估其最适反应温度，在估计值附近选择一个范围（士10C），测定酶在此温度 建立方法时，需要提前确定酶的最适反应湿度；区间酶活力的变化，从而确定该酵在某种反应体系中的最适温度；注1：从温血动物组织中提取的酶最适温度一般在35C~40℃之间：植物酶的最适温度一般在40C~50C之间：一在条件允许的情况下，应尽量选择在酶最适温度或附近温度下反应，还要依据实际条件调整反 大多数酶在60C以上会发生变性并逐渐失去活力.应温度，并通过其他反应条件的优化最终得到可行的检测方法：注2：有些检测设备或原理对于温度有一定限制，可以通过延长反应时间、增加底物或酶的浓废等途径得到改善和一有时，为了更好体现酶制剂在实际应用条件下的酶活力，需以实际应用时的温度条件作为反应 解决，温度.
5.1.3pH的选择
pH是酶活力测定的一个重要参数，选择方法如下：
一酶的最适pH需通过实验的方法测得，因底物的种类和浓度、温度、反应时间、缓冲液的种类和浓度等不同而不同：同一类酶的反应最适pH相近，酶制剂新产品可以参照现有的同类酶的反应最适pH，经过反一在选择最适pH时要保证酶的稳定性，把酵的反应pH曲线和酶的稳定pH曲线结合起来，选 应条件的筛选最终确定最适反应pH；择底物和缓冲溶液体系以达到最适的反应pH.
5.1.4缓冲溶液的选择
缓冲溶液的选择方法如下：
注1：缓冲溶液的作用不仅是维持酶反应的最适pH，其中含有的大量离子可以通过影响酶的构型或影响底物的解 一缓冲溶液的选择要充分考虑缓冲液的缓冲条件；离程度从而影响酶活性，因此，选择合适的缓冲体系及离子强度对于酶反应非常重要.缓冲溶液应具有足够的缓冲能力（缓冲液的电离平衡常数pK.与最适pH越接近，缓冲容量注2：酸和盐浓废相等时，缓冲液的缓冲效率为最高，比例相差越大，缓冲效率越低. 越大）：一随缓冲液浓度增加，电解质干扰酶和底物结合，酶活性将逐步下降，选择缓冲液浓度时，需在浓度较高以保持足够缓冲能力和浓度较低以免抑制酶活性两个作用之间取得平衡；对于解离受温度影响较大的缓冲物质（如Tris、三乙醇胺），配制、使用此类缓冲溶液时还应注一一缓冲溶液的选择要考虑离子强度的影响.在选择离子强度时，除了要保证反应体系的pH恒 意配制时的温度；定外，也应考虑它可能对反应体系及酶本身带来的影响：当缓冲溶液的pH、离子强度和缓冲离子选定后，该缓冲系统不应轻易变动.
5.1.5反应时间的选择
反应时间的选择方法如下：
一当反应测定的是最终产物的生成量时，不同酶活力大小的酶制剂在相同条件及反应时间固定的情况下，反应产物的生成量与酶制剂的活力成正比，反应时间可以通过在确定其他反应条件的基础上，不断调节酶促反应时间和适宜测定的反应时间来获得；
注1：从效率的角度考虑，时间越短越有效，但要同时考虚反应的稳定程度及结果的可靠性.
当反应测定的是产物生成的速率时，随着酶浓度的变化，酵与底物的反应速率成正比.要求酵制剂与底物的反应速率有足够的灵敏度，且动态变化的过程可通过一般的测量手段检测.确定反应时间时，需要注意测定出的产物量以及动态斜率两个参数，即在确保反应速率正常的情况下，注意产物的量在仪器测量最佳范围内.
注2：反应时间同样可以在反应底物、温度等其能条件确定的情况下通过实验测得，最初选取较长的反应时间范围，得到反应时间-产物浓度速率图，在初速度时间范围内可以结合仪器等的测量的要求来选择适合的范围.
5.1.6其他条件因素的选择
5.1.6.1激活剂
激活剂的选择方法如下：
作为酶的辅助因子，金属离子可以作为酶分子中的组成部分；作为酶的激活剂，如：KNaMg²Zn²Fe²Ca²和Co²等常见的酶的激活剂；注1：金属高子对不同的酶的作用具有一定的选择性，一些金属离子可能对某种酶具有激活作用-同时对另一种酶注2：不同的金属高子之间还有拮抗现象-如Na抑制K的激活作用，Mg²能够激活的酶又常被Ca所抑制. 起抑制作用.注3：金属高子的浓度对激活作用也有影响，随着浓度升高，它的作用可以从激活转化为抑制，如对于NAIDP合成酶，Mg²在5×10mol/1~10×10~mol/L 时，具有激活作用但当浓度上开至30×10 mol/1.时，醇活性-增加酶的稳定性，如枯草芽孢杆菌淀粉酶在Ca存在时对碱性环境的稳定性大为增加； 下降.强化酶的专一性，如羧肽酶A可以水解合成底物苯甲酰甘氨酰泵丙氨酸（BGP）和乳酸马尿酰苯酯（HPLA），如果将竣肽酶A中的Zn除去，再与其他金属离子重新结合，其对于BGP和激活剂可以分为无机离子、有机化合物和蛋白质三类. HPLA的相对活性会发生很大改变；
