中华人民共和国国家标准
GB/T 36840-2018
Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis
Detection and identification of
中国国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口.
和国上海出人境检验检疫局. 本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共
本标准主要起草人：高文娜、郑春生、骆卫峰、赵文军、易建平、张丽杰、边勇.
玉米内州萎病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了玉米内州萎蒿病菌（Clavibacter mrichiganensix subsp.nebraxkensis）检疫鉴定方法.本标准适用于玉米种子和玉米植株材料中的玉米内州菱病菌检疫鉴定.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法
3基本信息
中文名：玉米内州萎病菌
学名 :Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis (Vidaver &. Mandel 1974) Davis et al. 1984简称：CMN
leaf freckles of maize wilt of maize Nebraska leaf freckles and wilt leaf freckles and wilt 英文名:Goss’s wilt Goss’s wilt of maize Goss’s bacterial wilt and leaf blight blight of maize
分类地位：属细菌界Bacteria，放线菌门Actinobacteria，微球菌目Micrococcales，微球菌科Mi-crobacteriaceae，棒形杆菌属 Clavibacfer.
玉米内州萎嘉病菌的其他信息参见附录A
4原理
玉米内州萎端病菌的症状特征、菌落形态特征、生理生化特性、PCR反应和致病性测试结果是检测鉴定方法的依据.
5主要试剂与设备
5.1主要试剂
除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂.
氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、甲醇、乙醇、牛肉浸膏、聚蛋白陈、酵母提取物、蔗糖、琼脂、葡萄糖.
培养基和缓冲液配方见附录B.
5.2仪器设备
显微镜、超净台、电子天平、高压灭菌锅、冰箱、移液器、离心机、培养箱、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、实时荧光PCR仪、Biolog鉴定仪等.
6检测鉴定
6.1现场检疫
按照SN/T2122规定的方法进行现场检疫并抽取样品.
6.2实验室检测
6.2.1样品前处理
6.2.1.1种子样品
纸过滤后取浸泡液，10000r/min离心10min，1mLPBS悬浮沉淀，12-000r/min离心5min，弃上清 取100g种子样品放人三角瓶，加人200mL磷酸缓冲液（PBS缓冲液）（pH7.2），4C浸泡过夜；滤液，沉淀用DNA提取试剂盒提取DNA，样品如有种衣剂处理，先用自来水浸泡并洗去种衣剂.可用纱布包襄搓洗数次.
6.2.1.2植物材料
有症叶片取病健交界处2mm×2mm组织，置于载玻片上，加一滴无菌水，加盖玻片，置于显微镜下观察喷菌现象.如观察到喷菌现象剪取5块～10块症状组织，每块10mm×10mm，剪碎后加人1 mL生理盐水，室温浸泡1h，取浸泡液12000r/min离心5min，1mL灭菌水悬浮沉淀；沉淀悬浮液离心后沉淀提取DNA.
6.2.2PCR初检
样品DNA分别取1pL用于常规PCR或实时荧光PCR检测（见附录C和附录D），重复3次.
6.2.3病原菌分离
6.2.3.1种子样品
若PCR检测为阳性，另取种子样品100g，0.5%次氯酸钠表面消毒10min，灭菌水洗三次，加人200mLPBS缓冲液（pH7.4），4C浸泡过夜；120r/min振荡15min~30min，灭菌滤纸或纱布（4层~8层）过滤，滤液室温静置15min，取上清液，10000r/min离心15min，1mL灭菌水悬浮沉淀.取处理涂布5个～10个平板，28℃培养5d~7d后检查菌落生长情况.如发现疑似菌落，纯化3次后用 于后续试验，
6.2.3.2植物材料
5mm，70%乙醇表面消毒15s，无菌水洗三次后用无菌剪刀剪碎，置于无菌培养Ⅲ中，加200pL生理盐 若PCR检测为阳性，从症状组织的四个方向切取4个小块组织，每块均从病健交界处取5mm×水，室温浸泡1h，取浸泡液在NA培养基平板上划线分离，划线5个~10个平板，27C培养3d~5d.
6.2.4鉴定试验
6.2.4.1菌落形态特征
有光泽.挑取可疑菌落在NA培养基平板上纯化三次后进行鉴定.
6.2.4.2PCR 检测
分离物菌落纯化后，菌体提取DNA后进行PCR检测或实时荧光PCR检测，检测程序见附录C和附录D.PCR检测阳性的分离物进行后续测试.
6.2.4.3Biolog测试
分离物在NA上培养后转移至BUG培养基（见附录B）上，33C培养24h，按照Biolog使用说明，调整分离物菌悬液浊度加人BiologGN微孔板或GⅢ微孔板中，每孔100μL，微孔板33C培养18h后用Biolog仪读数，获得测试结果.
6.2.4.4烟草过敏性反应
分离物在NA上28C培养48h~72h后用无菌水配成108CFU/mL的菌悬液，采用组织渗透法接种善通烟叶背面，以无菌水作为对照，28C光照培养24h~48h后观察是否产生过敏性反应.
6.2.4.5致病性测试
分离物108CFU/mL菌悬液针刺接种玉米幼叶，进行致病性测试.选取健康甜玉米种子种植，在生出2片幼叶后，针刺小孔，接种菌悬浮液，保湿1d，室温下生长.接种7d~10d后观察接种点附近出现症状，根据柯赫氏法则，对发病子叶再分离病原菌，分离的病菌用PCR进行检测，完成了整个测试程序.
7结果判定
分离物的菌落形态特征与CMN相符，Biolog测试为CMN，PCR检测结果为阳性，烟草过敏性反应为阳性，致病性测试出现典型症状，判定为CMN.
8样品保存
理；分离菌株应妥善保存，将菌株转接到NA试管斜面上，28C培养48h.然后置于4C冰箱中保存， 阳性种子样品至少保存6个月，至少1000粒，以备复核、谈判和仲裁：阳性的植物材料及时销毁处定期（30d）转接：或在菌悬液中加人15%~30%甘油于一80℃下保存；必要时可将菌株冻干，一80℃下长期保存.
