中华人民共和国国家标准
GB/T 34795-2017
谷氨酰胺转胺酶活性检测方法
Determination of the activity of transglutaminase
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口.
本标准起草单位：深圳市计量质量检测研究院、中国测试技术研究院、四川省卫生和计划生育监督执法总队、深圳市职业技术学院.
本标准主要起草人：张世伟、赖心田、卢杰、王土峰、周李华、林霖、刘冬、唐栋、叶秀玲、兰全学、潘兰芳、杨国武.
谷氨酰胺转胺酶活性检测方法
1范围
本标准规定了茂原链轮丝菌（Sreptomyces mobaraensis）和天竺鼠（Caviaporcellas）来源的谷氨酰胺转胺酶活性检测方法.
本标准适用于生化试剂、工业产品中谷氨酰胺转胺酶活性的测定.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3.1
谷氨酰胺转胺酶活性单位transglutaminaseactivityunit
和羟胺形成1.0μmol的异羟肪酸盐所需的酶量为1单位，单位为U. 在37C、pH 6.0时，每分钟可催化N-苄氧基-L-谷氨酰甘氨酸（CBZ-Gln-Gly，CAS：6610-42-0)
4原理
酸-Y-单异羟肪酸可以通过三氯化铁显色，在525nm波长下具有特征吸收峰.因此可以通过外标法计 谷氨酰胺转胺酶能催化N-苄氧基-L-谷氨酰甘氨酸和羟胺生成L-谷氨酸--单异羟肪酸，L-谷氨算L-谷氨酸-7-单异羟孵酸的生成量测得酶活性.
5仪器设备及器具
5.1pH计：0.01级，5.2电子天平：感量0.0001g.5.3分光光度计.5.41cm石英比色Ⅲ.5.5恒温水浴槽：控温精度土0.5℃. 5.6离心机，
6试剂
本标准所使用的试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682中规定的二级水.
6.1Tris-HC1 缓冲液(pH 6.0 0.2 mol/L)
称取12.114g三羟甲基氨基甲烷（Tris），溶解在450mL水中，使用1mol/L盐酸调节pH至6.00土0.05，转人500ml容量瓶中，定容并摇匀.
6.2试剂A
称取 1.000 g N-苄氧基-L-谷氨酰甘氨酸，0.695 g 羟胺盐酸盐（Hydroxylamine hydrochloride)，0.307g还原型谷胱甘肽（GSH），溶解于Tris-HCl缓冲液（pH6.0，0.2mol/L），使用1mol/L氢氧化钠调节pH至6.00±0.05，用Tris-HC1缓冲液（pH6.0，0.2mol/L)定容至100mL.
6.33mol/L盐酸溶液
将36%~38%盐酸与水按体积比1：3稀释.
6.412%三氯乙酸（TCA）溶液
称取12.00g三氯乙酸溶于80mL水中，定容至100mL.
6.55%三氯化铁（FeCl）溶液
称取5.00g三氯化铁溶于0.1mol/LHCl中，定容至100mL.
6.6试剂B
由6.3、6.4、6.5所述溶液按体积比1：1：1混合，现配现用.
6.7L-谷氨酸-Y-单异经房酸标准储备液
称取0.1621g的 1-谷氨酸--单异羟肪酸（L-Glutamic acid7-monohydroxamate)，用10mL的Tris-HC1缓冲液（pH6.0 0.2mol/L）溶解后，转移至100mL的容量瓶中，用Tris-HC1缓冲液（pH6.0，0.2mol/L）定容并摇匀.
7分析步骤
7.1标准曲线的绘制
10mL的容量瓶中，再用Tris-HC1缓冲液定容至刻度，摇匀.1-谷氨酸-Y-单异羟肪酸的浓度分别是 分别移取L-谷氨酸-y-单异羟肪酸标准储备液0mL、0.2mL、0.5mL、1.0mL2.0mL和4.0mL到O μmol/mL、0.2 μmol/ mL0.5 μmol/mL、1.0 μmol/mL、2.0 μmol/mL 和l 4.O μmol/mL. 取 1 mL 试剂A与0.4mL不同浓度的L-谷氨酸-Y-单异羟酸标准溶液混合，37.0C±0.5℃C水浴10min，加0.4mL试剂B终止反应.使用1cm的石英比色Ⅲ，以L-谷氨酸-Y-单异羟污酸浓度为Oμmol/mL的标准溶液反应液作空白，在525nm处测定每个稀释液的吸光度.以L-谷氨酸--单异羟房酸浓度为横坐标，以时方可使用，否则需重做. 稀释液的吸光度为纵坐标做标准曲线，以最小二乘法得出线性回归方程.相关系数应在0.9990以上
7.2试验液的制备
称取样品0.1g.精确至0.0001g，用Tris-HCl缓冲液（pH6.0.0.2mol/L）溶解后，转移至合适容量瓶中并定容，使得最后的溶液中含有0.17U/mL~0.23U/mL的酶活力.
7.3测定
取1mL试剂A与0.4mL试验液混合，37.0℃±0.5C水浴10min，加 0.4mL试剂B终止反应.另取一只试管加人试验液，于95℃~100C水浴加热10min后，以5000r/min离心10min，取该上清液0.4mL，37℃水浴10min，加0.4mL试剂B终止反应，作为空白对照.用1cm的石英比色Ⅲl，在 525nm处测样品试验液和空白液的吸光度.样品试验液和空白液的吸光度之差即△A，将△A带入标准曲线线性回归方程计算试验液中L-谷氨酸-y-单异羟厉酸的浓度，
8结果
8.1结果计算
见式（1).
式中：
X谷氨酰胺转胺酶活性，单位为酶活力单位每克（U/g）；-为0.4mL试验液中生成的L-谷氨酸-Y-单异羟污酸浓度，单位为微摩尔每毫升（μmol/mL），从标准曲线中得出：V 为样品溶解液体积，单位为毫升（mL）；m-为样品质量，单位为克（g）： d 一为样品稀释倍数；10-为反应时间，单位为分钟（min）.计算结果保留三位有效数字.
8.2重复性
在重复性条件下获得的两次独立性测定结果差值的绝对值不得超过算术平均数的10%.
