中华人民共和国国家标准
GB/T 36843-2018
梨衰退植原体检疫鉴定方法
Detection and identification of Candidatus Phytoplasma pyri
中国国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口.
本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局.
本标准主要起草人：王有福、李鑫、于文涛、刘冉、冯茜茜、于爽、王秀芬、张寅寅、黑多尔、刘卉秋、胡强、曹冬梅.
梨衰退植原体检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了梨衰退植原体CandidaruxPhytoplasma pyri的检疫和鉴定方法.本标准适用于蓄薇科及夹竹桃科等植株及其繁殖材料和传播介体中梨衰退植原体的检疫和鉴定.
2梨衰退植原体基本信息
中文名：梨衰退植原体
学名：Caadidarus Phytoplasma pyri Seemuller &. Schneider
英文名 :pear decline;Parry's disease:peach yellow leaf roll;pear leaf curl;pear moria
分类地位：细菌界（Bacteria），硬壁菌门（Firmicutes），柔膜菌網（Mollicutes），非固醇菌原体目（Acholeplasmatales），非固醇菌原体科（Acholeplasmataceae），植原体属（Phyroplasma），16Sr X-C植原体组.
其他信息参见附录A.
3方法原理
梨衰退植原体症状和基因特性作为本标准鉴定方法的依据.
4仪器设备和主要试剂
4.1仪器设备
定性PCR仪、定量PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅、高速冷冻离心机、台式冷冻离心机、纯水仪、台式小型离心机、冰箱、旋涡震荡器、微量进样器、电泳仪、水浴锅、凝胶成像系统等.
4.2主要试剂
除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和去离子水，PCR反应体系用双蒸水.DNA提取试剂可参照附录B准备，其他试剂，比如各种溶液、缓冲液和培养基等检测方法特有的，按附录C、附录D 和附录E要求准备.商品化试剂参见其使用说明.
植物DNA提取试剂盒、PCR预混液（PCRPremix）、超纯水、DNA分子量标记（DNAMarker）及DNA提取试剂等.
核酸提取研磨液（100mL）：三水合磷酸氢二钾（KHPO；3HO），2.17g；磷酸二氢钾（KHPO），0.41g；蔗糖，10g；牛血清白蛋白（BSA），0.15g；聚乙烯吡略烷酮（PVP-10)，2g.pH7.6 高温灭菌，4C保存.
DNA 提取液:Tris-HC1 100 mmol/L:EDTA，100 mmol/L;NaCl 250 mmol/ L;调 pH 至 8.0.
50×TAE;2.0 mmol/L Tris 1.0 mmol/L 酷酸钠.50 mmol/L EDTA pH 8.0.
5检测方法
5.1症状观察
现场对梨树的种苗、枝条（带叶片）仔细观察：该病害可引起新梢生长不良，叶小，叶缘向上卷缩，叶量减少，叶脉变褐叶片变灰，呈革质.受侵染后的植株在第一年秋天可见叶片变红且提前脱落症状，第二年春天皇现叶子变小，且额色苍白，芽小或不长芽，不结果实.
梨树的种苗、枝条（不带叶片）：感染植株树势衰弱，终端生长减少或停止，严重时可引起整株萎缩或死亡.其最典型症状是在嫁接处，可见褐色线.
其余症状参见附录A.
选取可疑症状植株样品和随机样品带回实验室检测.
5.2分子生物学检测
5.2.1样品DNA提取
将采集的样品进行DNA提取（最好是疑似样品的叶脉部分），具体操作参见附录B.
5.2.2植原体巢氏PCR扩增及检测
采用植原体通用引物对P1/P7及梨衰退植原体特异性引物fPD/rPDs对进行果式PCR反应及凝胶电泳检测，具体操作步骤见附录C.
5.2.3序列比对及发育树分析
将上述序列进行测序后，在Genbank中进行比对，建立系统发育树进行亲缘关系分析.
5.2.4电子酶切图谱（RFLP）分析
采用植原体通用引物对P1/P7及R16F2/R16R2对进行巢式PCR反应，将获得片段进行测序后，应用软件进行分析.具体步骤及分析图谱见附录D.
5.2.5植原体实时荧光PCR检测
探针（LST Primer-F/LST Primer-R;LST Probe)进行扩增检测，具体操作方法见附录E. 针对梨衰退植原体16SrDNA的基因特性，采用梨衰退植原体的Cycleave实时荧光特异性引物和
6结果判定
6.1巢氏PCR检测
下，检测结果阴性：样品表现5.1所述症状，且5.2.2检测实验中空白、阴性对照无条带，阳性反应有条 样品表现5.1所述症状，且5.2.2检测实验中空白、阴性对照无条带，阳性反应有条带，样品无条带带，样品有条带，则判断样品携带梨衰退植原体病原.
6.2电子酶切图谱（RFLP）分析
经电子酶切图谱分析后，与附录D中图谱一致可判定该样品携带梨衰退植原体：若与电子图谱不一致，则判断为不携带梨衰退植原体.
6.3Cycleave实时荧光PCR检测
样品表现5.1所述症状，且5.2.4检测实验中空白、阴性对照无反应，阳性有反应，样品无反应，检测结果阴性：样品表现5.1所述症状，且5.2.4检测实验空白、阴性对照无反应，阳性有反应，样品有反应，则判断样品携带梨衰退植原体病原.
此外，样品表现5.1所述症状，经一种方法检测无阳性反应，建议采取另一种方法再次进行验证，均为阴性时，则判断样品不携带梨衰退植原体病原.
若为随机样本，不显症状植株，选取其中一种检测方法检测，阳性结果需用另一方法再次确认：阴性结果判定样品不携带梨衰退植原体病原.
7样品保存与结果记录
7.1样品保存
7.2结果记录
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字.PCR凝胶电泳检测应有电泳结果照片，实时荧光PCR检测应有扩增结果图片.
