中华人民共和国医药行业标准
YY/T1561-2017
组织工程医疗器械产品 动物源性支架材料残留α-Gal抗原检测
Tissue engineering medical device products-Remnant a-Gal antigen determination in scaffold materials utilizinganimal tissues and their derivatives
国家食品药品监督管理总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草，
请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任，
本标准由国家食品药品监督管理总局提出.
本标准由全国外科植人物和矫形器械标准化技术委员会组织工程医疗器械产品分技术委员会(SAC/TC110/SC3）归口.
本标准起草单位：中国食品药品检定研究院、中国人民解放军第四军医大学、冠吴生物科技股份有限公司.
本标准主要起草人：徐丽明、邵安良、陆艳、赵红妮、金岩、张勇杰、汤银喜、张伟、柴媛.
引言
器官移植中超急性免疫排斥反应及慢性免疫毒性的主要因素.尽管动物源性生物材料在制备过程中经 动物源性生物材料及含动物源性生物材料的医疗器械或异种器官中残留的抗原是该类生物材料及过了股细胞和去除抗原的处理，但残留的异种抗原仍存在着导致慢性免疫毒性反应的风险，
已有研究显示a-半乳糖基抗原（al，3galactosyle，Alphal，3Gal或aGal）是引起动物源性生物材料或异种器官移植时超急性免疫排斥反应的主要靶抗原.a-Gal的结构为Gala1-3Galβ1-4GlcNAc-R， 该抗原是半乳糖基与细胞膜上的蛋白或脂结合构成的一组完全性抗原.αrGal主要受αr1.3半乳糖基转移酯（al，3-galactosyltransferase，α-GT）及异红细胞糖苷酯合成酶（isoglobotriosylceramide synthase或isogloboside3synthase，iGb3S）调控，由于人体及类人狼、古世纪猴的半乳糖苷转移酶基因有2个碱基错位变异面不表达aGal抗原，但人肠道菌群持续表达a-Gal抗原，这种刻激致使人体免疫系统持续产生抗aGal抗体，达到循环免疫球蛋白的1%～3%.因此，当人体接受含有a-Gal抗原的生物材料 或异种器官移植时会引起超急性免疫排斥反应及慢性的免疫毒性反应，动物源性生物材料或异种器官移植中a-Gal抗原的去除成为降低免疫排斥反应和慢性免疫毒性反应的关键之一，目前，尚无动物源性生物材料中残留a-Gal抗原的定量检测方法，本标准通过使用a-Gal抗原特异性单克隆抗体M86，以人工合成的Gal-BSA抗原与Gal抗原阴性基质混合作为参照品建立标准曲线，通过竞争性ELISA抑制方法定量检测动物源性生物材料中残留的arGal抗原.同时，试验体系中加人了Gal抗原阳性和阴性参考品，使试验的灵敏性和特异性得以监控.
竞争性ELISA抑制方法是一种常用的方法，其原理是：首先将标准曲线样品及试验样品的aGal抗原与M86抗体反应（消耗部分M86抗体）：然后用Gal-BSA作为固相抗原，通过ELISA方法检测第一次反应后上清液中的剩余M86抗体：进面可利用标准曲线计算待测物中的a-Gal抗原含量.由于第一次待测物中的a-Gal抗原与M86抗体的反应对后续的剩余M86抗体与固相Gal-BSA抗原的反应构 成了抑制效应，故称为ELISA抑制法，
组织工程医疗器械产品 动物源性支架材料残留α-Gal抗原检测
1范围
的定量检测方法， 本标准给出了组织工程医疗器械产品支架材料制备时使用的动物源性生物材料中残留a-Gal抗原
本标准适用于制备组织工程医疗器械产品支架材料的各种动物来源的生物材料或其衍生物的α-Gal抗原检测，
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
(GB/T 16886.20-2015 ISO/TS 10993-20;2006 IDT)
YY/T0606.25组织工程医疗产品第25部分：动物源性生物材料DNA残留量测定法：荧光染色法
3术语和定义
GB/T16886.20和YY/T0606.25界定的术语和定义适用于本文件.
4试剂和仪器
4.1试剂
试剂包括：
a)磷酸盐缓冲液（PBS，phosphate buffered saline，pH 7.4）;b）碳酸盐缓冲液（pH9.5）；c)市售eGal Epitope（Gala1-3Galβ1-4GlcNAc-R)，mAb（M86），分装后-20C保存；d）市售Gala1-3gal-BSA（3atom spacer，简称Gal-BSA)，溶于去离子水中，分装后一20C保存e）辣根酶标记的山羊抗小鼠二抗（IgM-HRP）； 备用：f）TMB（3，3'，5，5'-Tetramethylbenzidine）显色液；g）血清白蛋白；h）裂解液（市售品），其主要组成成分包括：50mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris，pH7.4），150mmol/L氯化钠（NaCl），1%（体积分数）聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100），1%（质量 浓度）脱氧胆酸盐（sodiumdcoxycholate），0.1%（质量浓度）十二烷基硫酸钠（SDS），原钒酸钠（sodiumorthovanadate），氟化钠（sodiumfluoride），乙二胺四乙酸（EDTA），亮抑酵肽
YY/T 1561-2017
（leupeptin）及苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonylfluoride，PMSF）;i）洗液：0.05%（体积分数）的吐温-20/PBS；j）10%（体积分数）HSO：1)Gal抗原阴性生物材料参考品. k）Gal抗原阳性生物材料参考品：
4.2仪器
仪器包括：
a）37C恒温摇床； b）酶标仪；c）冷冻离心机；d）震荡器：e）高精度天平（0.0001g）；f）匀浆仪： g）移液枪；h)pH计.
5试验步骤
5.1样品准备
5.1.1试验样品
验样品，则用无菌眼科剪将样品剪裁成细小碎块，液态或粉末状试验样品无需特殊处理：加人裂解液（可使用市售品）配制成样品浓度为2mg/mL~10mg/mL[使用前加入1%（体积分数）1mmol/LPMSF，为操作方便推荐至少每份样品配制2mL的裂解液]，低温匀浆2min~10min，至样品全部粉碎，形成均匀组织匀浆：室温（25C±5C）放置30min~3h至样品全部裂解（肉眼观察无明显固态物质存在），离心（3000r/min~5000r/min）取上清备用，
注1：每份样品设平行样3份，最终测定结果取其平均值土SD.
注2：可以根据委托方的要求，取不同批号或同一批号的样品3份，用以评价不同批次或同一批次内的工艺稳定性.
5.1.2标准曲线样品
精确称取Gal抗原阴性生物材料参考品（冻干粉）样品2mg.置于2mL或5mL无菌离心管内，加入裂解液[使用前加人1%（体积分数）1mmol/LPMSF]配制成样品浓度为2mg/mL，含Gala1-3gal-BSA；室湿（25C士5C）放置30min~3h至样品全部发解，进行离心（3000r/min~5000r/min）后取上清液，用裂解液进行倍比梯度浓度稀释，得到最少不低于5个Gala1-3gal-BSA系列稀释浓度的稀释液，用于做标准曲线.为得到每次试验的最低检测限，应稀释到检测OD值与Gal抗原阴性参考品检测 OD值相等或相近的浓度，从而确定其上一个浓度为本次试验的最低检测限.
注：宜根据待测样品Gel抗原含量的高低，通过预实验确定Gala1-3gal-BSA的浓度范围，保证待测样品的检测OD值在标准曲线范围内.
5.1.3Gal抗原阳性和Gal抗原阴性参考品样品
分别精确称取2mgGal抗原阳性和阴性参考品（冻干粉），放于2mL或5mL无菌离心管内，加人2
