中华人民共和国国家标准
GB/T 36824-2018
Detection and identification of Mycosphaerella pini E.Rostrup
中国国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口.本标准起草单位：中华人民共和国安数出人境检验检疫局. 本标准主要起草人：李云飞、宗凯、姚剑、孙娟娟、华陈意、郑海松、余晓峰、陈雪娇、李刚、王满满、谢超.
松针红斑病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了松属（Pinas）、其他寄主植物及植物材料中松针红斑病菌检疫和鉴定方法.本标准适用于松属及相关种属苗木、枝叶中松针红斑病菌的检疫和鉴定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法
3松针红斑病菌基本信息
中文名：松针红斑病菌.
学名 :Mycoxphaerella pini E.Rostrup apud Munk(Envans 1984).异名：Eruprio pini （Rostr.）M. E. BarrScirrhia pini Funk &. A.K. Parker Cytosporina septospora G. DoroguineSeptoriella septospora (G. Dorog.) Sacc.Dothistroma pini var. lineare Thyr &. C. G. Shaw Actinoth yrium margingtum Sacc.Dothistroma septosporu var. lineare Thyr &. C. G. ShawDothistronia pini var. keniense M. H. IvoryDothistroma sepfos poram var keniense M. H. Ivory Dothistromia pini sensu auet. NZDothistroma sepros poram (G. Dorog.) M.MoreletDothistroma sepros porum (G. Dorog.) M. Morelet var septos porumSeptoria se ptospora (G. Dorog.) Arx
分类地位：真菌界（Fungi），子囊菌门（Asycota），座囊菌纲（Dothideomycetes），煤复目（Capnodiales），球腔菌科（Mycosphaerellaceae），球腔菌属（Mycosphaerella）.无性型为 Dothistroma se pto-xporum（Dorog-）Morelet.松针红斑病菌的其他信息参见附录A.
4方法原理
据，寄主及地理分布作为辅助鉴定依据. 本方法以松针红斑病菌的为害症状，形态特征、培养性状及分子生物学特征作为检疫鉴定的主要依
5器材和试剂
5.1器材
透视显微镜、超净工作台、电子天平、培养箱、高压灭菌锅、恒温水浴锅、纯水仪、涡旋振荡器、高速冷
GB/T 36824-2018
冻离心机、荧光定量PCR仪、可调移液器（1000pL，200pL，20μL，10μL，2.5μL）、培养Ⅲ、烧杯、三角瓶、镊子、手术刀、剪刀、载玻片、盖玻片、量筒、吸管、酒精灯、移植环、研钵、液氮罐、标签等.
5.2试剂
无水乙醇、次氯酸钠、CTAB缓冲液、酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、液氮、实时荧光PCR预混液、引物和探针，麦芽浸膏琼脂培养基（MEA）：2%麦芽浸膏、2%琼脂、pH值为5土0.2.
6抽样方法
按SN/T2122进行抽样.
7现场查验
叶尖端坏死、病斑上是否有红褐色斑点、段斑以及黑色斑点（参见附录B）.将疑似感病样品或无症样品 检查幼苗、针叶是否有浅绿色、黄色至红褐色的病斑，针叶是否坏死、脱落.观察坏死针叶是否为针标识清晰后带回实验室做进一步检验.
8实验室检验
8.1切片检验
选取疑似感病样品，剪取带有黑色斑点或凸起裂口的针叶组织（约5mm），用刀片对有黑点或裂口组织块进行徒手切片，用移植环将切薄的组织片移至载玻片中央的水滴中，在显微镜下观察子囊座、子囊孢子或分生孢子盘、分生孢子等病原菌相关特征.如针叶病斑上未发现黑点或裂口，可将有病针叶在20C条件下保湿培养约20d，观察是否长出黑点或裂口，若长出则进行切片镜检.如针叶病斑组织切 片中的子囊座或分生孢子盘尚未见成熟的孢子，可将有病针叶在20C下保湿培养1d~2d，待孢子成熟后再做切片镜检.
8.2分离培养
10min.用无菌水冲洗3次后置于麦芽浸膏琼脂平板上，20C恒温光照（16h光照，8h黑暗）培养2周～4周后镜检.期间要仔细观察菌落的生长状态并做记录.
8.3形态观察
从菌落中挑取少许培养物，以水作浮载剂，制成玻片，在显微镜下观察.
8.4实时荧光PCR检测
松针红斑病菌的实时荧光PCR检测方法见附录C.
9病菌形态特征
9.1有性阶段
针叶输向的裂缝突出于表皮（参见附录B）.子囊座黑色，大小为（400μm~1000μm）×（300μm~ 子囊座在落叶上形成，通常位于红斑区，最初埋生于表皮下，成熟后不规则地或通过1个～2个沿2
400pm），具单或多腔.子囊为囊状至圆柱状，双囊壁，大小约为（35μm~55μm）×（6μm~9pm），内有8个子囊孢子，子囊孢子呈透明椭圆形，具圆形先端，具1个分隔，通常有4个油滴状斑点，大小(10 μm~15 μm) × (3 μm~ 4 μm) .
9.2无性阶段
病菌不规则地分布于坏死区、部分死亡针叶组织上，有时会聚集于红斑处，分生孢子盘最初埋生于针叶表皮下，呈腔室状，成熟时呈稀圆形，平行于针叶长轴排列.分生孢子盘黑色，大小为（300pm~650μm）×（150jm～300μm），基座由厚壁的假薄壁细胞组织组成.成熟的分生孢子盘在潮湿条件下多数为2个~3个分隔.具有圆形先端和截型基部，（12μm~48pm）×（2pμm~3μm）.
9.3培养性状
20℃下菌丝每周生长1.5mm~2.0mm，菌丝生长最适温度为20℃C~25℃，菌丝生长最适pH值为3~5.
9.4与近似种的区别
松针红斑病菌与近似种的区别见表1.
表1松针红斑病菌与近似种的区别
名称 Mycos phaerella pisi 松针红斑病菌 Mycospierellα dearuessi 松针褐斑病菌 Mycos phaerella gibsonii 松针褐枯病菌无色、壁薄、光滑.大小为 茶褐色或烟褐色壁厚、上布黑色 淡黄褐色壁薄、光滑.分生孢子大分生孢子 ~ ur z）×(u g~u z1) 疣状突起.分生孢子大小为 小为(20 μm~ 68 pm) × (2.5 μm~(u g 在MEA培养基上生长缓慢. 在MEA培养基上生长速度略 (11 μm~64 μm × (1 μm~6 ycm) 4 5 μm120℃下菌落直径每周生长 快，20C下菌落直径每周生长 在MEA培养基生长速度最快，菌培养性状 1.5 mm~2mm.菌落呈灰 色、棕色至黑色.平板上形成 黑色有橄榄绿色的抱子黏液 2.5 mm~3 mm.菌落呈绿色至 落呈灰色毛绒状轻微的红褐色色斑 平板上产生黄色色斑症状 福色 松针上病斑浅绿色、黄色至红 松针上病斑褐色 松针上病斑浅绿色、黄褐色至灰色
10结果判定
如果样品具有该病的典型症状，且切片或分离培养的病菌形态特征与第9章的描述相符，即可判定为检出松针红斑病菌：如果分离培养的病菌形态特征与第9章的描述相符，且实时荧光PCR检测为阳性，亦可判定为检出松针红斑病菌.
11样品、菌种保藏
行冷冻干燥保存.检出病菌的样品标识清晰后妥善保存6个月，保存期满灭活处理. 分离菌转接在MEA培养基斜面上，待斜面表面长满菌丝后，置于4C保存，定期转接，有条件可进
