ICS 65.020 B04 中华人民共和国国家标准 GB/T28660-2012 马铃薯种薯真实性和纯度鉴定 SSR分子标记 Genuineness andpurityverification ofpotato seed-tuber- SSRmolecularmarker 2012-09-03发布 2012-11-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布
GB/T28660-2012 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。
本标准由中华人民共和国农业部提出。
本标准由全国农作物种子标准化技术委员会（SAC/TC37)归口。
本标准起草单位：云南师范大学薯类作物研究所、中国农科院蔬菜花卉研究所、东北农业大学农学 院、华中农业大学园艺学院、黑龙江省农业科学院农业部脱毒马铃薯种薯质量监督检验测试中心、国际 马铃薯中心(CIP)北京联络处。
本标准主要起草人：李灿辉、郝大海、金黎平、杨仕忠、管朝旭、黄三文、陈伊里、谢从华、白艳菊、 谢开云。
GB/T 28660-2012 马铃薯种薯真实性和纯度鉴定 SSR分子标记 1范围 本标准规定了SSR分子标记鉴定马铃薯（SolanumtuberosumL.）品种的方法。
本标准适用于马铃薯种薯真实性和纯度的检测。
2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。
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GB18133马铃薯脱毒种薯 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。
3.1 简单序列重复simple sequence repeat;SSR 3.2 聚合酶链式反应polymerasechainreaction；PCR 在耐热DNA聚合酶作用下，于体外快速大量特异性扩增特定DNA序列的方法。
4仪器和试剂 4.1仪器及用具 4.1.1梯度PCR仪。
4.1.2低温高速离心机。
4.1.3电泳仪（满足3000V稳压）及配套电泳槽。
4.1.4凝胶成像分析系统。
4.1.5冰箱（-28℃~4°℃）。
4.1.6紫外/可见分光光度计。
4.1.7电热恒温水浴锅（37℃、42℃、65℃和95℃）。
4.1.8制冰机。
4.1.9涡旋仪。
4.1.10高压灭菌器。
4.1.11液氮罐。
4.1.12酸度计(pH计)。
4.1.13脱色摇床。
GB/T28660-2012 4.1.14微量移液器(0.5μL~10μL、10μL~100μL、100μL~1000μL)及配套的枪头。
4.1.15其他用具：PCR管、量筒（100mL~1000mL)、1.5mL离心管和配套的研磨棒。
4.2试剂 4.2.1常用贮备液：见附录A。
4.2.2DNA提取试剂：见附录B。
4.2.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂：见附录C。
4.2.4银染试剂：见附录D。
4.2.5SSR（简单重复序列)标记引物：见附录E。
4.2.6TaqDNA聚合酶（Taq DNApolymerase)和配套的PCR缓冲液。
4.2.7DNA Marker (50 bp、100 bp、150 bp、200 bp、250 bp、300 bp、350 bp、400 bp、500 bp)。
4.2.8无 DNA 酶的 RNA酶A(DNase-free RNase A,10 mg/mL)。
4.2.9β-硫基乙醇。
4.2.10四甲基二乙胺(TEMED)。
4.2.11异丙醇。
4.2.12乙醇(70%、90%、95%)。
4.2.13灭菌双蒸水(ddH2O)。
5供试材料 5.1取样 按照GB18133要求的方法，采集大田植株或块茎作为检测样品。
5.2样品保存 选取适量样品，装人冻存管，液氮速冻，置冰箱（一20℃以下)中保存备用（有效保存期约6个月）。
6程序 6.1总DNA提取 6.1.1称取100mg样品，置于预冷1.5mL离心管中，液氮冷冻下迅速研磨成细粉。
依次加人700μL 的两倍十六烷基三甲基溴化铵缓冲液（见表B.1)和2μL的β-硫基乙醇，涡旋混匀。
6.1.2置65C水浴1h，期间每隔10min摇动混匀一次。
合，轻缓颠倒混匀数次。
12000r/min离心5min。
6.1.4吸取上层水相至新1.5mL离心管中，加人等体积(400μL～500μL)的预冷异丙醇。
轻缓颠 倒混匀，4C冰箱静置30min后，12000r/min离心15min。
6.1.5弃上清液。
向离心管中加人70%乙醇1.0mL...
