中华人民共和国医药行业标准
重组胶原蛋白肽图指纹图谱分析
Peptide mass fingerprinting analysis of rebinant collagen
国家药品监督管理局 发布
目 次
前言1范围2规范性引用文件3术语和定义4缩略语5概述6试剂及其配制、仪器 7操作方法8测定结果分析9报告参考文献
前言
本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由国家药品监督管理局提出.
本文件由中国食品药品检定研究院归口.
本文件起草单位：四川省药品检验研究院（四川省医疗器械检测中心）、中国食品药品检定研究院、岛津企业管理（中国）有限公司、中国科学院过程工程研究所.
李晓东、徐丽明. 本文件主要起草人：刘兴兰、高建萍、冀峰、范行良、卢华、赵登位、邢芳毓、黄元礼、赵代国、张贵锋、
重组胶原蛋白肽图指纹图谱分析
1范围
本文件描述了重组胶原蛋白肽图指纹图谱的分析方法，包括肽图、肽段覆盖率、异质性分析.本文件适用于重组胶原蛋白的肽图指纹图谱分析.
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文本文件. 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于
GB/T6682分析实验用水规格和试验方法YY/T1849重组胶原蛋白中华人民共和国药典（2020年版）
3术语和定义
YY/T1849界定的以及下列术语和定义适用于本文件.
3.1
肽图指纹图谱peptide mass fingerprinting
采用适宜的特异性酶将蛋白质裂解为肽段，经可靠方法分离和鉴定后获得的特征性图谱，它可提供待测蛋白质的肽段序列信息.
4缩略语
下面缩略语适用于本文件.DTT：二硫苏糖醇（Dithiothreitol)IAA ;碘乙酰胺(lodoacetamide)Tris：三羟甲基氨基甲烷[Tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane] HC1;盐酸(Hydrochloric acid)
Tris-HCl:三羟甲基氨基甲烷盐酸盐[Tris(hydroxymethyl）amino methane hydrochloride]
5概述
参照《中华人民共和国药典（2020年版）中3405，将重组胶原蛋白样品用适宜的蛋白酶酶解（如胰蛋白酶），用高效液相色谱进行分离获得肽图指纹图谱：利用高效液相色诺-高分辨率质谱技术进行分析得到多肽一级、二级谱图，然后与理论氨基酸序列酶解肽段四配，进行胶原蛋白肽段覆盖率分析，用于评价重组胶原蛋白的符合性.
利用肽图指纹图谱可进行异质性分析.例如，N端甲硫氨酸，信号肽或前导序列和其他可能的
YY/T 1954-2025
N端、C端修饰以及各种其他翻译后修饰（如脱酰胺化、氧化、异构化、碎片化、二硫键错配、N-连接和O-连接的寡糖、糖基化、聚集等），评价产品工艺及其监测工艺的稳定性.
6试剂及其配制、仪器
6.1试剂
6.1.1乙睛、甲酸：用于高效液相色谱-质谱检测时使用质谱纯，用于高效液相色谱检测时使用色谱纯. 除特别注明外，试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682的要求.6.1.2胰蛋白酶：序列纯.取20μg的酶加人200pL0.1mol/LTris-HCl溶液（pH8.0）溶解成0.1pg/uL的溶液（也可按照说明书配制使用）.6.1.30.5%醋酸溶液（V/V）：量取0.5mL冰醋酸加水并定容至100mL. 6.1.40.1mol/LTris-HCI溶液（pH 8.0):称取0.121gTris溶于5mL水中，用6mol/L 的盐酸调 pH至8.0，加水定容至10mL，2℃~8℃保存.6.1.58mol/L盐酸胍溶液：称取7.64g盐酸胍，加水溶解并定容至10mL，混匀即得，2℃～8℃保存.6.1.61 mol/L DTT溶液：称取0.154 2gDTT 加水1.0mL 溶解即得，-20C保存.6.1.71mol/L1AA溶液：称取0.1849gIAA，加水1.0mL 溶解即得，2℃C~8C避光保存.
6.2仪器
6.2.1分析天平：精度0.00001g；6.2.2离心机；6.2.3水浴锅或恒温箱： 6.2.4涡旋仪；6.2.5高效液相色谱仪：6.2.6高效液相色谱-质谱仪[例如，液相色语-四极杆飞行时间高分辨质谱仪（LCMS-QTOF）、液相色诺-静电场轨道阱高分辨质诺仪（1CMS-Orbitrap）等].
7操作方法
7.1供试品溶液制备
7.1.1不含二硫键供试品溶液制备
7.1.1.1供试品溶解
不同性状的供试品溶解方法如下：
固体供试品：称取5mg（精确到0.00001g）重组胶原蛋白供试品置于15mL离心管中，加人5 mL 0.1 mol/L Tris-HC1 溶液(pH 8.0)溶解;液体供试品：取液体供试品适量，置超滤管（10kDa）中，以相对离心力11000g离心10min，加人100 pL 0.1 mol/LTris-HCl(pH 8.0)溶液，11 000g 离心10 min，去掉外层套管中过滤掉的液 体，再次在超滤管中加人100μL0.1mol/LTris-HCl(pH 8.0）溶液，11 00Og离心10min，去掉外层套管中过滤的液体，重复此操作至外层套管中滤液pH约为8.保留超滤管中的供试品，在超滤管中加人100μL0.1mol/LTris-HCl（pH8.0）溶液，反复吹打，将溶液吸到0.5mL的离心管中.蛋白浓度约为1mg/mL.
注：供试品也可以采用其他经验证对异质性无影响的溶别溶解.
