中华人民共和国国家标准
GB/T 35517-2017
Chemicals-Fish short term reproduction toxicity assay
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
目次
前言引言1范围2术语定义和缩略语3方法述4质量保证与质量控制5仅器设备6试验准备6.1试验用水 6.2鱼的驯养6.3预暴露和鱼的选择7试验程序7.1一般说明7.2试验浓度的选择8试验过程.8.1受试鱼的选择与称重8.2暴露条件 8.2.1时间8.2.2驯养8.2.3灯光和温度8.3测试规率 8.4观察.8.4.1死亡率8.4.2行为和表观8.4.3生殖力8.4.4鱼的安乐死 8.4.5第二性征的观察8.4.6卵黄蛋白原测定8.4.7性腺组织病理学评价9数据和报告9.1采用方差分析（ANOVA）对生物标志物响应进行评价9.2试验结果报告附录A（资料性附录） 进行卵黄蛋白原分析的样品收集推荐程序附录B（资料性附录）检测特定内分泌活性物质对黑头呆鱼和青的第二性征的评估 附录C（资料性附录）鱼类内分泌筛选试验的实验条件 1621
附录D（资料性附录）斑马鱼和黑头呆鱼的产卵基板 23附录E（资料性附录）可接受的稀释水的一些化学特性 25附录F（资料性附录）卵黄蛋白原加标和批间标准品分析附录G（资料性附录）统计分析流程附录H（规范性附录）试验结果闸释和可接受性的标准参考文献.
图A.1用剪刀沿着胸鳍前剪开 图A.2用剪刀沿着腹部中线伸人腹部离肌门头部大约2mm处 8图A.3采用手术钳撑开腹壁，暴露肝脏以及其他内部器官（或者将腹壁横向固定）图A.4采用手术钳缓慢分离和切除肝脏图A.5采用手术钳缓慢摘取肠道图 A.7 图A.6肠道以及任何肠系膜的附属物的终端采用剪刀切割 （雌鱼）对于雌鱼过程相同 11 11图 A.8 完成整个过程 12图A.9斑马鱼鱼头鱼尾的切分 15图B.1 图B.2 臀鳍形状和尺寸的性别差异 黑头呆鱼珠星的数目和尺寸 17 19图B.3 臀鳍线的结合板上的突起过程图B.4 带有切割点的鱼身照片图D.1 斑马鱼产卵基板 23图D.2黑头呆鱼产卵基板 图G.1统计分析流程图 24 27
表B.1黑头呆鱼珠星模板表C.1鱼类内分泌筛选试验的实验条件 21表E1可接受的稀释水的一些化学特性
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准技术内容与经济合作与发展组织（Organization for Econonic Cooperation and Development.OECD）测试导则229（2012年）（鱼类短期生殖毒性测试（2012））（英文版）技术内容一致.
本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会（SAC/TC251）提出并归口.
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中国合格评定国家认可中心、宁波出人境检验检疫局、广东省微生物分析检测中心、中国化工经济技术发展中心、上海市检测中心.
本标准主要起草人：程艳、崔媛、唐伟、孙运、陈会明、李海山、谢文平、曹梦然、股浩文、张京估、曾国驱、梅承芳.
引言
本试验方法描述了一种体内筛选试验方法，将性成熟的雄鱼和处于产卵期的雌鱼一起暴露于化学品中21d.在21d暴露期结束时，对雄鱼和雌鱼的生物标志物终点进行测定，作为测试化学物质内分泌活性指标.这些测试终点包括卵黄蛋白原和第二性特征对黑头呆鱼、日本青鳞和斑马鱼可进行卵黄保留性腺，可通过病理组织学来评估测试动物的生殖健康，也为其他测试终点提供更有力的证据. 蛋白原测定，而第二性征只能在黑头呆鱼和日本青鳍上测定.在整个测试过程中每天都要监测繁殖力：
卵黄蛋白原通常受循环的内源性雌激素的刺激，由雌性卵生脊椎动物的肝脏产生.卵黄蛋白原是卵黄蛋白的前体，一旦在肝脏中产生，由血流进人卵巢，被发育中的卵吸收并修饰.卵黄蛋白原在未成熟的雌鱼和雄鱼的血浆中几乎检测不到，因为它们缺乏足够的循环雌激素，但在受外激性的雌激素的刺 激下，肝脏能够合成并分泌卵黄蛋白原.
卵黄蛋白原的测定能够检测不同雌激素作用模式的化学品，对雌激素类化学品的检测，有可能通过测量雄鱼的卵黄蛋白原的产生.在雌性体内的雌激素循环水平的降低，例如通过抑制转化内源性雄激抑制性质的化学品.
采用已建立标准化的常规检测方法.采用免疫化学的物种特异性的酶联免疫吸收分析（ELISA）方法，收集黑头呆鱼的血液、斑马鱼的血液或头/尾的匀浆以及青的肝脏，作为VTG测定的样品.对于青鳞，在血液中测量的VTG与肝脏中所测具有良好的相关性.附录A提供了对于卵黄蛋白原分析的样品收集的推荐程序.卵黄蛋白原可采用不同的试验方法，但都得基于验证的物种特异性ELISA方法.
特定物种雄鱼的第二性征是可观察的，与内源性雄激素循环水平呈定量响应性这些特性在黑头呆鱼和青鳞上能体现，但斑马鱼没有体现，因为斑马鱼不具备可定量的第二性征.
对于黑头呆鱼，外源受试物暴露的主要指标是位于雌鱼唇部珠星的数量.对于青鳞，乳突物的数目组成了雌鱼的外源性暴露于雄激素受试物的主要标志物.附录B分别说明了对于黑头呆鱼和青的 性特征评价的过程.
为期21d的鱼类测试包括定量产卵量和性腺组织病理学检测.试验中可能会需要额外的终点对受试生物生殖健康进行更完整的评估，或者防止卵黄蛋白原和第二性征对化学品暴露没有响应.虽然某些终点是可得出明确结论（例如雄性诱导形成卵黄蛋白原、雌性诱导形成珠星），但并不是测试的终点（例如生殖力和性腺组织病理学）直接表明毒性作用机制.另外，对于某些终点，可通过内分泌干扰 来推测.虽然不是特定的内分泌作用，但由于对内分泌干扰活性物质表现出敏感性，所以生殖力是可考虑的重要终点.因为当它和其他终点不受影响时，能够更加确定的是此化合物很可能不具有内分泌干扰活性.而当生殖力受到影响，会对推论提供强有力的证据.本测试提供了进一步进行数据结果解释和测试结果可接受性的指导.
