中华人民共和国国家标准
GB 4789.3-2016
食品安全国家标准
食品微生物学检验大肠菌群计数
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 国家食品药品监督管理总局 发布
前言
本标准代替GB4789.3-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》、食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测方法》大肠菌群计数部分.
本标准与GB4789.3-2010相比，主要变化如下：
增加了检验原理；修改了典型菌落的形态描述； 修改了适用范围；修改了第二法平板菌落数的选择：修改了第二法证实试验：修改了第二法平板计数的报告.
食品安全国家标准
食品微生物学检验大肠菌群计数
1范围
本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法.高的食品中大肠菌群的计数. 本标准第一法适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群的计数：第二法适用于大肠菌群含量较
2术语和定义
2.1
大肠菌群Coliforms
在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌.
2.2最可能数Mostprobable number;MPN
基于泊松分布的一种间接计数方法.
3检验原理
3.1MPN法
MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法.待测样品经系列稀释并培养后，根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数.
3.2平板计数法
大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸，在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色，带有或不带有沉淀环的菌落，
4设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
4.1恒温培养箱：36℃士1℃4.2冰箱：2℃~5℃.4.4天平：感量0.1g. 4.3恒温水浴箱：46C土1℃.4.5均质器.4.6振荡器.4.8无菌锥形瓶：容量500mL. 4.7无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头.4.9无菌培养Ⅲ：直径90mm.
4.10pH计或pH比色管或精密pH试纸.4.11菌落计数器.
5培养基和试剂
5.1月桂基硫酸盐胰蛋白陈（lauryl sulfate tryptose，LST)肉汤：见 A.1.5.2煌绿乳糖胆盐（brilliant green lactose bile，BGLB）肉汤：见 A.2. 5.3结晶紫中性红胆盐琼脂（violet red bile agar，VRBA）:见A.3.5.4无菌磷酸盐缓冲液：见A.4.5.5无菌生理盐水：见A.5.5.61 mol/L NaOH 溶液：见A.6. 5.71mol/LHCl溶液：见A.7
第一法大肠菌群MPN计数法
6检验程序
大肠菌群MPN计数的检验程序见图1.
图1大肠菌群MPN计数法检验程序
7操作步骤
7.1样品的稀释
7.1.1固体和半固体样品：称取25g样品，放人盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯 内.8000r/min~10000r/min均质1min~2min，或放人盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min~2min，制成1：10的样品匀液.7.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）或其他无菌容器中充分振摇或置于机械振荡器中振摇，充分混匀，制成1110的样品匀液.7.1.3样品匀液的 pH 应在6.5~7.5 之间，必要时分别用1 mol/L NaOH 或 1 mol/L HCl调节. 7.1.4用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1mL.沿管壁缓缓注人9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1：100的样品匀液.7.1.5根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液.每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头.从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min.
7.2初发酵试验
每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白陈（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36C士1C培养24h士2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h士2h产气者进行复发酵试验（证实试验），如未产气则继续培养至48h土2h，产气者进行复发酵试验，未产气者为大肠菌群阴性.
7.3复发酵试验（证实试验）
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃土1℃培养48h土2h，观察产气情况.产气者，计为大肠菌群阳性管.
7.4大肠菌群最可能数（MPN）的报告
按7.3确证的大肠菌群 BGLB阳性管数，检索MPN表（见附录 B)，报告每g(mL)样品中大肠菌群的 MPN 值.
第二法大肠菌群平板计数法
8检验程序
大肠菌群平板计数法的检验程序见图2.
