中华人民共和国粮食行业标准
粮油检验 粮食中黄曲霉毒素B、B2、 G、G2的测定 超高效液相色谱法
Inspection of grain and oils-Determination of aflatoxin B，B，G Gin grains-Ultra-high performance liquid chromatography
国家粮食局发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由国家粮食局提出.
本标准由全国粮油标准化技术委员会（SAT/TC270）归口.
本标准起草单位：国家粮食局科学研究院、湖南国家粮食质量监测中心、吉林省粮油卫生检验监测站、黑龙江粮油卫生检验监测站、北京农业质量标准与检测技术研究中心.
本标准主要起草人：谢刚、王松雪、李丽、黎睿、叶金、王媛媛、吴宇、辛媛媛、倪小英、石家源、罗雁、陆安祥.
粮油检验粮食中黄曲霉毒素B、B2、 G、G的测定超高效液相色谱法
1范围
本标准规定了粮食及其制品中黄曲霉毒素B、B、G、G：超高效液相色谱法测定的原理、试剂与仪器设备、分析步骤、结果计算等内容.
本标准适用于粮食及其制品中黄曲霉毒素B、B、G、G：的测定，
本标准方法黄曲霉毒素B 检出限为0.2μg/kg，定量限为0.4μg/kg：黄曲霉毒素G检出限为0.5μg/kg，定量限为1.5μg/kg；黄曲霉毒素B、G:检出限为0.1μg/kg，定量限为0.3μg/kg.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T602化学试剂杂质测定用标准溶液的制备GB/T5491粮食、油料检验扦样、分样法GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
用提取液提取试样中的黄曲霉毒素B、B、G、G，免疫亲和柱净化、富集后，通过配有大流通池的超高效液相色谱仪进行测定，外标法定量.
4试剂与仪器设备
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中一级用水要求.
4.1试剂
4.1.1甲醇（CHOH）：色谱纯.4.1.2乙睛（CHCN）：色谱纯.4.1.3氯化钠（NaC1）：分析纯.4.1.4甲醇水溶液：量取70体积甲醇（4.1.1）.加入30体积水，混匀.其他试剂符合GB/T602的要求.
4.2标准品
4.2.1黄曲霉毒素标准品（黄曲霉毒素B、B、GG）：纯度≥99%；或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质.4.2.2标准储备液：分别称取黄曲霉毒素B（AFB）、黄曲霉毒素B（AFB）、黄曲霉毒素G（AFG1）、
黄曲霉毒素G：（AFG）标准品（4.2.1）各0.1mg（精确至0.01mg），用甲醇（4.1.1）溶解并定容至10mL，
LS/T 6128-2017
得到浓度约为10μg/mL的储备液.一20C避光保存.
4.2.3混合标准液：准确移取适量的AFB、AFB、AFG、AFG：标准储备液（4.2.2）于100mL容量瓶中，甲醇（4.1.1）定容，得到混合标准液浓度分别为AFB，和AFG：100μg/L，AFB和AFG：30μg/L-20C避光保存.
4.2.4混合标准工作液：准确移取适量混合标准溶液（4.2.3）至10mL容量瓶中，用甲醇（4.1.1）定容，配制成AFB和AFG 浓度为0.1μg/L~50μg/L AFB;和AFG浓度为0.03μg/L~15.0μg/L的系列标准工作液，备用.4C避光密封保存，有效期一周.
4.3材料与仪器设备
4.3.1黄曲霉毒素总量免疫亲和柱4.3.2 定性滤纸：412cmWhaman4号，或性能相当者4.3.3 玻璃纤维滤纸：49onWhatm 滤膜：0.22m 扎径，有 mGF/A.或性能相当者.4.3.4 4.3.5 注射器：20 L 机相（所选用滤膜应采用标准溶液检验聊认无吸附现象，方可使用）.4.3.6 离心管： ml4.3.7 三角瓶 2504.3.8 量简4.3.9 4.3.10 天平 速粉 感量 碎机. 0.1g和 0mg4.3.11 气吹 开仪4.3.12 速均 质器：转递 ain4.3.13 4.3.14 心机 转速≥5 用振荡器（药频率4.3.15 空 多 压） 力泵，4.3.16 mm孔径4.3.17 液相色谱格：C18柱（柱长50mm或100mm，柱内径2.1mm，填料粒 1.7 m），或性能相4.3.18超高效液相色潜仪：包括超高效液相色谱仪、超高压液相色谐仪和超高递表相色谱仪，配备荧 当者.光检测器和数据处票 系统.色谱参考条件：色谱柱：C18柱（4.3.17）荧光检测波长：激发波长360mm发射波长440nm. 流动相：A：甲醇，B：水，等度洗脱，A：B-4060.流速：0.2mL/min.柱温：30℃进样量：2pl
5分析步骤
5.1扦样与分样
按GB/T5491执行，在采样过程中，注意防止样品污染.
5.2样品制备
5.2.1提取
样品用高速粉碎机（4.3.10）粉碎，过1mm孔径试验筛（4.3.16），混合均匀后，取有代表性样品不少中，加人5.0g氧化钠和100mL（V ）甲醇/水溶液（4.1.4），高速均质提取2min，或者使用调速多用振荡 于500g.供检测用.准确称取25.0g（m，精确到0.1g）充分均匀的试样，置于均质杯或250mL三角瓶器（4.3.14）振荡提取30min.用定性滤纸（4.3.2）过滤或转移25mL的提取液于50mL的离心管中，于5000r/min离心5min.取10mL（V）滤液或离心管中上层液体，加人40mL（V）水稀释，混匀后用玻璃微纤维滤纸（4.3.3）过滤或于7000r/min离心10min.滤液或离心液备用.
5.2.2免疫亲和柱净化
将免疫亲和柱（4.3.1） 与20ml注射器（4.3.5）下端连接，准确移取20mL）上述滤液或离心管中上层液体于注射器中 将空气低力泵（4.3.15）与注射器另一端连接，调节压为使溶流以约1滴/s的流速缓慢通过免疫亲和 性，直至空气进人亲和柱中，用10mL水淋洗亲和柱2次，商速为 滴/s~2滴/s，弃掉全部流出液，抽 品瓶中，准确加 干免费 亲和柱.准确加人1mL（V）甲醇（4.1.1），流速为1滴/收集查 水满旅混合30过0.22gm滤膜（4、34），作为待测样流，供液相色谱测定， 全部洗脱液于样0.4 mL
注：由于不 同厂商提供的亲和柱操作程序可怕有折不落实五操作时，通参图免疫亲和桂厂商继供的操作说明和程
5.3标准曲线的制作
黄曲霉毒素B、B、G 工作液由低到高准确移瑕1.0mL太.4mL水锅旋湿合308，注入液相色谐检测分析.以黄曲容海素B、民、GG：标准工作液浓度为横坐标，相对应色语峰峰面积为纵坐标，建立标准工作曲线
5.4试样溶液的遗定
待测样液（62）中特测化合物的响应值应在标准曲线线性范围内，浓度超过线连范图的样品则应重新按5.2进行处理符合要求后再进样分析.待测样液中黄曲霉毒素B、Bs、G 的法度为c1.液相色谱图参见附录A
5.5空白试验
不称取试样，按5.2的步骤做空白实验，分析得到空自试样中待测物 的浓度为c
5.6平行试样
按5.2所述步骤，对同一试样进行平行试验测定.
6结果计算
样品中黄曲霉毒素B、B、G、G的含量按式（1）、式（2）计算：
其中：
（2）
