中华人民共和国粮食行业标准
粮油检验 粮食中伏马毒素B、B2的测定 超高效液相色谱法
Inspection of grain and oils-Determination of fumonisins B ，Bin grainsUltra-highperformanceliquidchromatography
国家粮食局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草，
本标准由国家粮食局提出.
本标准由全国粮油标准化技术委员会（SAT/TC270）归口.
本标准起草单位：国家粮食局科学研究院、安徽国家粮食质量监测中心、黑龙江粮油卫生检验监测站、湖南国家粮食质量监测中心、遂宁市粮食质量监督检验站、北京农业质量标准与检测技术研究中心.
本标准主要起草人：谢刚、黎睿、李丽、叶金、王松雪、吴宇、胡斌、徐春修、许艳霞、李小明、李森、陆安祥.
粮油检验粮食中伏马毒素B、B的测定 超高效液相色谱法
1范围
本标准规定了粮食及其制品中伏马毒素B、B：超高效液相色谱法测定的原理、试剂与仪器设备、分析步骤、结果计算等内容.
本标准适用于粮食及相关制品中伏马毒索B、B：的测定.
本标准方法伏马毒素B、B:的检出限为0.05mg/kg，定量限为0.25mg/kg.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件，
GB/T602化学试剂杂质测定用标准溶液的制备 GB/T5491粮食、油料检验扦样、分样法GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
用提取液提取试样中的伏马毒素B、B，经免疫亲和柱净化、富集后，用邻苯二甲醛衍生，超高效液相色语荧光检测器测定，外标法定量.
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中一级水的要求.
4.1试剂
4.1.1甲醇（CHOH），色谱纯.4.1.3四硼酸钠（NaBO 10HO）：分析纯. 4.1.2乙晴（CHCN)：色谱纯.4.1.4氯化钠（NaCI）：分析纯.4.1.5磷酸氢二钠（NaHPO）：分析纯.4.1.6磷酸二氢钾（KHPO）：分析纯. 4.1.7氯化钾（KCI）：分析纯.4.1.8浓盐酸（HCI）：分析纯.4.1.9乙酸（CHCOOH）：色谱纯.4.1.10邻苯二甲醛（OPA.CHO）分析纯.4.1.112-硫基乙醇（CHOS）：分析纯. 4.1.120.1mol/L四硼酸钠溶液：称取3.8g四硼酸钠（4.1.3），用水溶解并定容至100mL.
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4.1.132mol/L盐酸溶液：将1体积浓盐酸（4.1.8）溶解在5体积水中.
4.1.14乙晴水溶液（5050）：取50体积乙晴（4.1.2）加人50体积水.
4.1.15磷酸盐缓冲液（PBS）：将8.0g氰化钠（4.1.4）、1.2g磷酸氢二钠（4.1.5）、0.2g磷酸二氢钾容为1L.
4.1.161%乙酸水溶液：量取99体积水，加入1体积乙酸（4.1.9）.
4.1.17衍生溶液：取40mg邻苯二甲醛（4.1.10）加人1mL甲醇（4.1.1）溶解，加人0.1mol/L四硼酸钠溶液（4.2.1）5mL稀释，加人2-硫基乙醇（4.1.11）80μL.混匀.过0.22um滤膜后，存于具塞棕色瓶中，在室温避光处可储藏1周.
4.1.182%乙酸化甲醇：量取98体积甲醇（4.1.1），加人2体积乙酸（4.1.9）.
其他试剂应符合GB/T602的要求.
4.2标准品
4.2.1伏马毒素日 和B 标准品：品体，纯度95%：或经国家认证并授子标准物质证书的标准物质.4.2.2伏马毒素 标准储备液：使用伏马毒素标准物质溶液；或准确称取适量 马毒素 B和B标准品（4.2.1），用乙随水溶 mg/L的标准情备液.一20C避光保存.4.2.3伏马毒素混合标准整液准确玻取适 （4.1.14）定容，摇匀，配成伏或毒素B 素氏、B标准储备液 的湿合标准济液 （4.22）.用 乙晴水溶液4.2.4伏马毒意标准工作法 分到 混 溶液 2.3）.用乙晴水溶液（41.14）稀释，配成伏马毒素 、B浓度 ng/L g/L、1.0 L、5.00mg/L的标准工作液.
4.3材料与仪设备
4.3.2滤膜.22m，有机系4.3.4 伏马毒素 单疫亲和柱：对伏马毒素B和B.均有100%的交叉反应性4.3.5 注射器：204.3.6 离心管：10mL、 mL4.3.7 三角瓶：250ml4.3.8 4.3.9 天平：感量0.1g和0.01mg. 量筒：100mL.10ml.4.3.10 高速粉碎机，4.3.11 空气压力泵，4.3.12 氮气吹干仪.4.3.13 4.3.14 高速均质器：转速6500r/min~24000r/min. 离心机：转速≥5000r/min.4.3.15 调速多用振荡器（振荡频率≥150次）.4.3.16 泵流操作架.4.3.17 样品瓶：2ml. 试验筛：1mm孔径.4.3.18 4.3.19 玻璃内衬管：250pL.
4.3.1快递定性流纸：12cmWhatmn-号：成性虚相当荐
4.3.3玻璃微纤维滤纸：g9cmWhatmanGF/A，或性能相当者.
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4.3.20液相色谱柱：C18柱（柱长50mm或100mm，柱内径2.1mm，填料粒径1.7μm），或性能相当者.
4.3.21超高效液相色谱仪：包括超高效液相色谱仪、超高压液相色谱仅和超高速液相色谱仪，配备荧光检测器和数据处理系统.
色谱参考条件：
色谱柱：C18柱（柱长50mm或100mm.柱内径2.1mm，填料粒径1.7μm），或性能相当者.
进样量：2μL
5分析步骤
5.1扦样与分样
5.2样品制
5.2.1提取
样品用高速粉碎机（4.0粉，过1m 经试验蒂 3.11），混合均匀后，取有世表性样品不少于500g，供检测用，称取25.0g（院确到0.1 100mL（V，乙腊溶液（4.1高 ）充分混匀的法样，置可均质杯或250ml三角瓶中，加人30min.用定性滤（4.3.1）过能或转移5 均质： 成者用测速多用报高器（53.15振荡提取 m正的离心管中，于5000/min离心5min.取1.5mLV）滤液或离心管中上层体：排 5L（V)PBS级冲液（4.115）稀释，混匀，于7000r/min离心10in，离心液备用
5.2.2净化
将免疫亲和柱（4. mL注射器（4.3.5）下端连接，将上述36.5 L离液（V）全部注入注射器内，将空气压力泵（4. 11）与注射器连接，调节压力使溶液以约 滴/s的流速缓慢通过免疫亲和柱，直至空气进人亲和柱中，依次用10mLPBS缓冲液（4.6）、10mL水 淋洗亲和柱，流速为1滴/s~2滴/s，弃掉全部流出液，抽干免疫亲和柱.免疫亲和柱中注人3 mL酸化甲醇（4.1.18），流速以1滴/s缓慢流出，收集全部洗脱液于10mL离心管中，在55C下氮气吹干，准确加人0.5mL（V）乙晴水溶液 （4.2.3）溶解残留物，涡旅混合30s.过0.22pm滤膜（4.3.2），备用.
注：由于不同厂商提供的亲和柱操作程序可能有所不同，实际操作时，也可参照免疫亲和柱厂商提供的操作说明和程序使用，
5.3衍生化反应
分别取上述净化液和标准工作液（4.2.4）各100pL，置于装有内衬管（4.1.19）的样品瓶中，加人100μLOPA衍生液（4.1.17），混合均匀后，静置3min，作为待测液，应立即进样分析.
5.4标准曲线的制作
将衍生后伏马毒素标准系列溶液（4.2.4）由低到高浓度检测分析.以伏马毒素浓度为横坐标，相对
