NY
中华人民共和国农业行业标准
NY/T3112-2017
Determination of isoflavones in vegetable oils-Liquidchromatography tandem mass spectrometry
中华人民共和国农业部发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准起草单位：中国农业科学院油料作物研究所、农业部油料产品质量安全风险评估实验室（武 本标准由农业部种植业管理司提出并归口.汉）、农业部油料及制品质量监督检验测试中心.本标准主要起草人：李培武、马飞、王秀嫔、张文、汪雪芳、喻理、胡小风.
植物油中异黄酮的测定液相色谱一串联质谱法
1范围
本标准适用于植物油中大豆黄酮业、染料木苷、大豆黄酮、染料木素标准4种异黄酮含量的测定.本标准方法大豆黄酮苷、染料木苷、大豆黄酮、染料木素的检出限均为0.3μg/kg.
本标准规定了植物油中异黄酮含量的测定方法.
2规范性引用文件
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3方法原理
4试剂与材料
4.11大豆黄酮标准品（CHO，CAS号：486-66-8)：含量≥98.0%.
4.12染料木素标准品（CgHO，CAS号：486-72-0)：含量≥98.0%.
4.13异黄酮化合物标准溶液配制：
4.13.1标准储备溶液：分别精密称取10.0mg大豆黄酮苷（4.9）、染料木苷（4.10）、大豆黄酮（4.11）、染料木素（4.12）标准品，用甲醇（4.1）溶解，并定容于10mL棕色容量瓶中，分别配制成浓度为1.0mg/mL的标准储备溶液，一20℃C以下避光保存.
4.13.2混合异黄酮标准储备液：分别精密量取1.0mg/mL的大豆黄酮苷、染料木苷、大豆黄酮、染料
NY/T3112-2017
木素标准储备溶液（4.13.1)1mL，于100mL容量瓶中用甲醇（4.1）稀释至刻度，配制成大豆黄酮苷、染
4.13.3混合异黄酮标准工作溶液：分别吸取一定量的混合异黄酮标准储备液（4.13.2），用甲醇十水 料木苷、大豆黄酮、染料木素浓度为10.0μg/mL的混合异黄酮标准储备液，-20C以下避光保存.（4.8）稀释成浓度分别为0.50μg/L、1.00pg/L、5.00μg/L、10.0μg/L.20.0μg/L、50.0μg/L、100μg/L、200μg/L和400g/L的标准工作溶液.现用现配.
5仪器和设备
5.1液相色谱一串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）.5.2分析天平：感量土0.0001g 5.3振荡器.5.4涡旋振荡器.5.5固相萃取仪.5.6氮吹仪.5.7低温冰箱：温度可低至一20℃.5.8固相萃取柱：二醇基固相萃取柱（500mg/6mL），或性能相当者.5.9微孔滤膜：0.22μm，有机系.
6取样和试样保存
6.1取样
取样按照GB/T5524的规定执行，实验室收到的样品应具有真实的代表性，且在运输和储藏过程中未受到损害或变质.
6.2保存
试样于4C以下冰箱中避光保存.
7分析步骤
7.1试样的制备
称取约0.5g（精确至0.01g）试样至10mL离心管中，然后加人5mL正已烷（4.4），涡旋1min混匀，储存在4℃条件下，备用.
7.2净化
将二醇基固相萃取柱放在固相萃取仪上，依次用5mL甲醇（4.1）和5mL正已烷（4.4）活化，控制流速1mL/min.将待净化液加人固相萃取柱中，用5mL10%乙酸乙酯正已烷（4.7）淋洗，弃去：再用6mL甲醇（4.1）加人到固相萃取柱中，用10mL离心管收集洗脱液.将离心管置于氮吹仪上，水浴 温度50℃，氮吹至近干，1.00mL50%甲醇水（4.8）复溶，涡旋30s后过0.22gm滤膜过滤，待液相色谱串联质谱测定.
7.3液相色谱一串联质谱测定
7.3.1液相色谱参考条件
a）色谱柱：Cg，柱长100mm，内径2.1mm，粒径3.0gm，或性能相当者：b）流动相：A为0.01%乙酸水（4.5），B为0.01%乙酸甲醇（4.6）；c）流速：0.20mL/min;e）流动相梯度洗脱程序见表1. d）进样量：10gL;
表1流动相梯度洗脱程序
时间，mi A.% B %0 2 90 90 10 102.5 70 305 8 30 45 55 7013 15 8513.5 16 90 90 10 10
7.3.2质谱参考条件
a) 离子源：电喷雾离子源；b) 扫描方式：正离子扫摘；c) 检测方式：选择离子监测（SRM）：d) 喷雾电压、碰撞能等参数应优化至最优灵敏度； 辅助气、鞘气、碰撞气均为高纯氮气或其他合适气体；e) f) 监测离子参数情况见表2.
表2大豆黄酮苷、染料木苷、大豆黄酮、染料木素定量离子和定性离子参考质谱条件
化合物 保留时间，min 定量离子对，m/z 定性离子，m/ 碰撞气能量，eV 透镜电压.V大豆黄酮苷 6.3 417/255 417/199 22/45 160染料木苷 大豆黄 6.9 8.3 433/271 255/199 255/137 30/26 27 127 132染料木素 9.0 271/153 271/215 27/125 127
7.3.3定性测定
内，并且色谱图中各组分定性离子对的相对丰度，与浓度接近标准工作液中相应定性离子对的相对丰度进行比较，若偏差不超过表3规定的范围，则可判断为样品中存在对应的待测物.
表3定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差
单位为百分率
相对离子丰度 >50 20~50（含） 10~20（含） <10允许的相对偏差 ±20 ±25 土30 士50 7.3.4定量测定 取混合标准工作液与试样交替进样，采用单点或多点校准，外标法定量.当样品的上机液浓度超过线性范围时，需根据测定浓度，稀释后进行重新测定.大豆黄酮苷、染料木苷、大豆黄酮、染料木素标准溶液的选择离子监测色谱图参见附录A. 8结果计算 样品中异黄酮化合物含量以质量分数W计，单位为微克每千克（pg/kg），按式（1）计算. 式中： W 样品中异黄酮化合物含量，单位为微克每千克（pg/kg）；
