中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 4525.7-2016
出口食品中致病菌的分子分型 MILST方法第7部分：空肠弯曲菌
Multilocus sequence typing detection method for pathogens in export fodPart7:Campylobacterjejuni
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
SN/T4525《出口食品中致病菌的分子分型MLST方法》共分10个部分：
第2部分：金黄色葡萄球菌： 第1部分：沙门氏菌；第3部分：副溶血性弧菌：第4部分：霍乱弧菌：第5部分：克罗诺杆菌：第6部分：化链球菌： 第7部分：空肠弯曲菌；第8部分：致泻性大肠埃希氏菌：第9部分：单核细胞增生李斯特氏菌：第10部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌.
本部分为SN/T4525的第7部分.
本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.
本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.
本部分起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中国食品安全风险评估中心、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、上海交通大学.
本部分主要起草人：蒋原、薛峰、陈额、袁芳、郭云昌、王姆、曾德新、蒋鲁岩、封振、吕敬章、施春雷、史贤明.
MLST方法第7部分：空肠弯曲菌 出口食品中致病菌的分子分型
1范围
SN/T4525的本部分规定了出口食品中空肠弯曲菌分子分型M1ST检测方法.
本部分适用于出口食品中空肠弯曲菌的分子分型检测
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用 文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括 的修改单适用于本文件
GB4789.9食品安全国家标准食品微生物学检验 空肠弯曲菌检验GB/T6682分析实验室用水规格 和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 GB19489实验室生物安全通用要求
3术语和定义、缩略语
3.1术语和定义
3.1.1 下列术语和定义适用于本文件.
管家基因house-keeping genes
细胞中均要表达的一类基因，其产守并且在大多数情况下持续表达.
物是对维持细胞基本生 命活动所必需的，其基因序列高度保仅称看家基因，持家基因.
3.1.2
Taq DNA 防Thermus aquaticus DNA polymers
3.2缩略语
dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate）EDTA：乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)MLST：多位点序列分型（multilocus sequence typing)Tris三（羟甲基）氨基甲烷[rris（hydroxymethyl）aminomethane]
下列缩略语适用于本文件.
ST，序列型(Sequence Type)
4原理
MLST是通过测定多个管家基因中长度约为470bp核心片段的核苷酸序列.对其组合进行索引编
SN/T 4525.7-2016
号，不同的菌株对应不同的序列型，从面揭示菌株间等位基因的多样性.MLST分型中多个管家基因的序列分析比较在实验过程的操作性与结果的可靠性之间取得了平衡，且结果准确，所得数据在不同的实验室间具有良好的可比性.
5试剂和材料
除有特殊说明外，实验用试剂均为分析纯或生化试剂：实验用水符合GB/T6682中一级水的要求.试剂均用无DNA酶污染的容器分装.5.1DNA提取试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒. 5.2TaqDNA酶.5.3 dNTP;dATP dTTP dCTP dGTP.5.4引物：扩增引物和测序引物序列见表A.2.5.510×PCR缓冲液：200mmol/L Tris-HCI(pH 8.4).200mmol/L 氯化钾.15mmol/L 氯化镁.5.6琼脂糖凝胶. 5.7Gelred核酸染色剂.5.86×溴酚蓝上样缓冲液.5.9分子量标记：100 bp DNAmarker.5.105×TBE电泳缓冲液：445mmol/LTris.445mmol/1.硼酸.10mmol/1. EDTA(pH 8.0).使用5.11质控菌株：空肠弯曲菌Campylobacter jejumi subsp.jejuniNCTC11168或等效菌袜. 时稀释为0.5×TBE电泳缓冲液.
6仪器和设备
6.1离心机.6.3pH计.6.4涡旋振荡器.6.7凝胶成像仪，6.8基因测序仪，6.9超净工作台，6.10移液器;0.1 μL~2.5 pL、2 μL~20μL 20μL~200μL、100μL~1 000 μl
6.2天平：量程2kg.感量0.1g.
6.5PCR仪.
6.6电泳仪.
7检测程序
根据空肠弯曲菌的7个管家基因，设计PCR引物和测序引物序列（见附录A）.通过目的基因片段的PCR扩增，再进行PCR产物的纯化和DNA序列测定，将所得到的空肠弯曲菌7个管家基因测序结 果与GenBank中的已有的相关基因进行BLAST，将上下游序列整合后得到完整序列，为减小误差首尾的几个碱基不计算人序列测定结果.最后将测序结果上传至MLST网站（hrtp：// 曲菌分离株的序列型（SequenceType，ST），并与PubMLST数据库中菌株的资料进行比较.在确定2
附录B).
MLST分子分型操作程序见图1.
图1多位点序列分型（MLST）操作步骤
8操作步骤
8.1细菌基因组DNA提取
将经过GB4789.9的方法进行鉴定为空肠弯曲菌的菌株提取基因组DNA.
8.2MLST基因选择
按表A.1所示，选择空肠弯曲菌的7个管家基因进行MLST分析.
8.3PCR扩增引物和测序引物的选择
按表A.2中的序列，合成空肠弯曲菌7个管家基因对应的7对PCR扩增引物和7对测序引物.引物在使用前按照相应分子量进行稀释到10μmol/L，一20C保存备用.
8.4目的基因片段的PCR扩增
1 min，50 ℃ 1 min 72 ℃ 1 min，30 个循环;72 “℃ 10 min. 采用50μLPCR反应体系.gltA、aspA、pgm和uncA基因的反应条件为：94℃4min;94C
