中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法 第14部分：芝麻
Food allergen detection with LAMP methods for exportPart 14:Sesame
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
SN/T4419（出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法）由下列部分组成：
第1部分：开心果：
第3部分：胡桃：
本部分为SN/T4419的第14部分.
本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草
本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.
本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、广州迪澳生物科技有限公司.
本部分主要起草人：徐君怡、曹际娟、陈颖、于灵、郑秋月、赵昕、徐杨、曹冬梅、肖娜婚、张璜.
出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法 第14部分：芝麻
1范围
SN/T4419的本部分规定了出口食品中过敏原芝麻成分的环介导等温扩增（1AMP）检测方法.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件3.1.1
芝麻sesame
别名：胡麻，脂麻，属胡麻科（地区.
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件.dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）LAMP：环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification）
TritonX-100：聚乙二醇辛基苯基醚
4防污染措施
环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T27403-2008中附录D的规定.
5方法提要
样品经研磨后，提取DNA.以DNA为模板，采用芝麻2S球蛋白基因特异性检测引物进行LAMP扩增，通过颜色变化观察判定是否存在过敏原芝麻成分.
6LAMP检测方法
6.1原理
根据芝麻2S种子贮存蛋白基因序列设计特异性内引物、外引物（和环引物）各一对，特异性识别靶序列上的6或8个独立区域.在链置换型DNA聚合酶的作用下，内引物与模板DNA退火、延伸，并利内引物合成链折叠成茎-环结构，以自身为模板，启动链置换扩增循环，合成长度不一的大量茎-环结构 用外引物与模板DNA的退火延伸置换出内引物合成链.由于内引物与相邻区城存在互补区，游离的DNA，加人显色液，即可通过反应液的颜色变化观察判定结果，DNA聚合反应析出的焦磷酸根离子
显色液显色原理：SYBRGreenI是一种结合于dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色荧光的染料.在游离状态下，SYBRGreenI发出微弱的荧光，但一且与dsDNA结合后，荧光大大增强.因此， SYBRGreenI荧光的强度与dsDNA的量正相关，可以根据LAMP反应液的荧光强度测定反应体系中的dsDNA的量.
6.2仪器和设备
6.2.1水浴锅或加热模板：65C±1℃和80℃±1℃.6.2.3计时器. 6.2.2离心管：0.1ml、1.5ml.6.2.4移液枪：量程0.5pL~10pL、量程10μL~100μL、量程100gL~1000μl
6.3试剂和材料
6.3.2CTAB 提取缓冲液（20 g/L CTAB. 1. 4 mol/L. NaCI 0.1 mol/1. Tris-HCl. 0 02 mol/1. 6.3.1实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格.Na EDTA pH 8 0).6.3.3CTAB沉淀液（5g/L CTAB.40mmol/LNaCl).6.3.4NaCl溶液:1.2mmol/L6.3.5蛋白酶K（20mg/ml.).6.3.7BsrDNA聚合酶：酶浓度8U/L 6.3.6dNTPs溶液：每种核苷酸浓度10mmol/L6.3.810×ThermolPol级液：含200mmol/1. Tris-HCI(pH 8 8)、100 mmol/1.硫酸铵、100 mmol/L氧化钾、20mmol/L硫酸镁、1%TritonX-1006.3.9硫酸镁溶液：50mmol/L6.3.10甜菜碱：5mol/1 6.3.11显色液：SYBRGreenI荧光染料.1000×.6.3.12引物：根据芝麻2S球蛋白基因设计一套特异性引物，包括外引物F3/B3.内引物FIP/BIP.环
引物FLP/BLP.见表1.
表1引物序列
名称 编号 序列外侧上游引物（F3） S'- ATGGTGGTGAAGAGGATGA-3'外侧下游引物（B3） 5'- GATAACTCGGAATTGGCATTG-3'LAMP引物序列 内侧上游引物（FIP) 5′- TTAGGCAAGCAGTGAGGCAGCTAGCCCTCTGGTAAACCT-3* 5'-CTCGTCCACGTTCCTCAGCCTGGAAATGAGCACTGGG-3'内侧下游引物（BIP) 5'- CTGCTCGGACTGCTGATT-3′上游环引I物（FLP) 下游环引物（BLP） 5'-TACCAGGAGGGCCAATCA-3'
6.4DNA提取
6.4.1称取100mg已制备好的样品至1.5mL离心管中，加人1mL.CTAB提取缓冲液和10μL蛋白酶K，65C1h.期间每隔10min振荡混匀.6.4.3加入490μL氯仿，振荡混合后，12000g离心10min. 6.4.4吸取500μL上清波至一新1.5mL管中.6.4.5加人2倍体积CTAB沉淀液，混匀后室温静置60min.12000g离心10min.6.4.6弃去上清液，加人350L1.2mmol/LNaCl溶液充分溶解沉淀.6.4.7加人350μL氯仿，高速涡振荡混匀，12000g离心10min.6.4.8吸取上清液至一新1.5mL管中，加人0.8倍体积异丙醇，混匀，-20°C静置20min，12000g离 心10 min.6.4.9弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000g离心10min.
6.4.212000g离心10min，吸取上清液700l至一新1.5mL离心管中.
6.4.10弃去上清液，晾干.加人100μL.TE缓冲液，溶解DNA沉淀，-20°C保存备用.
6.5实验步骤
6.5.1阴性对照、阳性对显和空白对显的设置
阴性对照：采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板.
阳性对照：采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板或含有目的基因序列的质粒DNA代替DNA模板.
设两个空白对照：
提取DNA时设置的提取空白对照（以水代替样品）；
LAMP反应的空白对照（以DNA溶解液代替DNA模板）.
6.5.2芝麻LAMP反应体系
中，不要粘附于管壁上.在反应体系配制完成后，将1μL显色液滴在管盖内侧，盖管盖时应小心，防止 LAMP反应体系见表2.每个样品各做2个平行管.加样时应使样品DNA溶液完全加人反应液显色液混合进入反应液中.
