中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 4419.13-2016
出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法 第13部分：葵花籽
Food allergen detection with LAMPmethods for exportPart 13:Sunflower seed
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
SN/T4419《出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法》由下列部分组成：
一第1部分：开心果； 第2部分：腰果；第3部分：胡桃：第4部分：榛果：第5部分：杏仁；第6部分：扁桃仁； 第7部分：巴西圣果；第8部分：澳洲坠果；第9部分：栗子：第11部分：羽扇豆： 第10部分：大豆；第12部分：花生：第13部分：葵花籽：第14部分：芝麻：第16部分：小麦： 第15部分：大麦；第17部分：荞麦：第18部分：芥末；第19部分：胡萝卜：第21部分：牛奶； 第20部分：芹菜：
第22部分：虾.
本部分为SN/T4419的第13部分.
出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法 第13部分：葵花籽
1范围
SN/T4419的本部分规定了出口食品中过敏原葵花籽成分的环介导等温扩增（LAMP）检测方法.本部分适用于食品及其原料中过敏原葵花籽成分的定性检测
本部分所规定方法的最低检测限（LOD）为0.5%（质量分数）.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水现格和试验方法
GB/T27403-2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
3.1.1 下列术语和定义适用于本文
过敏原 allergen
又称致敏原或变应原，是指能够可3.1.2
葵花籽 sunflower seed
葵花籽又名葵瓜子、葵子，是菊科向日娄属草本植物向日葵Heianthusamnuus的种子.
3.2缩略语
dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate） 下列缩略语适用于本文件.LAMP：环介导等温扩增（loop-mediated isothermalamplification）
TritonX-100：聚乙二醇辛基苯基醚
4防污染措施
环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T27403-2008中附录D的规定，
5方法提要
样品经研磨后，提取DNA，以DNA为模板，采用葵花籽HaG5基因特异性检测引物进行LAMP扩
SN/T 4419.13-2016
增，通过颜色变化观察判定是否存在过敏原葵花籽成分.
6LAMP检测方法
6.1原理
6个独立区域，在链置换型BsDNA聚合酶的作用下启动循环链置换反应，在特异靶序列启动互补链 根据葵花籽HaG5基因序列设计特异性内引物、外引物和环引物各一对，特异性识别靶序列上的合成在同一链上互补序列周面复始形成有很多环的花椰菜结构的蒸-环DNA混合物：从dNTP析出可通过颜色变化观察判定结果.
小沟内.当它与dsDNA结合时，荧光信号是游离状态的800-1000倍.在不发生扩增反应时，SYBR 显色液显色原理：SYBRGreenI是一种高灵敏的DNA荧光染料，可以嵌人方式结合到dsDNA的GreenI染料分子的荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色：当发生扩增反应时，随着dsDNA的增加，SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表dsDNA分子的数量，同时颜色由橙色变为绿色.
6.2仪器和设备
6.2.1水浴锅或加热模板：63℃±1℃和80℃士1℃6.2.2离心管：0.1mL、1.5ml.6.2.3计时器.6.2.4移液枪：量程0.5pL~10μL、量程10pL~100μL、量程100xL~1 000xL.
6.3试剂和材料
除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂.6.3.1实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格.6.3.2CTAB提取缓冲液（20g/LCTAB.1.4mol/LNaCl 0.1mol/1.Tris-HCl.0.02mol/LNaEDTA.pH 8.0). 6.3.3CTAB沉淀液(5 g/L CTAB.40mmol/L NaCl).6.3.4NaCl溶液：1.2mmol/L6.3.5蛋白酶K（20mg/mL).6.3.6dNTPs溶液：每种核苷酸浓度10mmol/L6.3.7BsDNA聚合酶：酶浓度8U/L 6.3.810×ThermolPol缓冲液：含200mmol/LTris-HCl(pH 8.8）、100mmol/L硫酸铵、100mmol/L氯化钾、20mmol/L.硫酸镁、1%TritonX-1006.3.9硫酸镁溶液：50mmol/l6.3.10甜菜碱：5mol/L6.3.11显色液：SYBRGreenI荧光染料，1000×. 6.3.12引物：根据葵花籽HaG5基因设计一套特异性引物，包括外引物F3/B3，内引物FIP/BIP，环引物FLP/BLP.见表1.
表1引物序列
名称 编号 序列外侧上游引物（F3） 5'- CTCCAGCAGTGTTGTCAA-3*外例下游引物（B3） 5'-GGATATCGATATTGCTCTCGG-3*LAMP引物序列 内侧上游引物（FIP） 5′-GTTGCTGTTGTACTTGCTGCTG AAACATCGAAGGGCAGTG-3*内侧下游引物（BIP） 5′-GGTTCGCAGCAGACCCAA TGAAGGTTGCATACGTTAGG-3*上游环引物（FLP） S'TCGGAACACCTGCTTCAC-3*下游环引物（BLP） 5'-TTGAAGCAGAAGGCTCAGATT-3*
6.4DNA提取
6.4.1称取100mg已制备好的样品至1.5mL离心管中，加人1mLCTAB提取缓冲液和10μL蛋白
酶K，65C1h.期间每隔10min振荡混匀.6.4.3加人490pL氯仿，振荡混合后，12000g离心10min.6.4.5加人2倍体积CTAB沉淀液，混匀后室温静置60min，12000g离心10min. 6.4.4吸取500μl.上清液至一新1.5ml管中.6.4.6弃去上清液.加人350pL1.2mmol/LNaCl溶液充分溶解沉淀.6.4.7加人350μl.氯仿，高速涡旋振荡混匀.12000g离心10min6.4.8吸取上清液至一新1.5ml管中，加人0.8倍体积异丙醇，混匀，-20°℃静置20min.12000g离6.4.9弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀一次.12000g离心10min. 心10 min.
6.4.212000g离心10min，吸取上清液700pL至一新1.5mL离心管中.
6.4.10弃去上清液，晾干，加入100pLTE缓冲液，溶解DNA沉淀，一20°C保存备用.
6.5实验步骤
6.5.1阴性对照、阳性对照和空白对照的设置
阴性对照：采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板.
阳性对照：采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板或含有目的基因序列的质粒DNA代替DNA模板，
设两个空白对照：
提取DNA时设置的提取空白对照（以水代替样品）；
-LAMP反应的空白对照（以DNA溶解液代替DNA模板）.
6.5.2葵花籽LAMP反应体系
LAMP反应体系见表2.每个样品各做2个平行管.加样时应使样品DNA溶液完全加人反应液中，不要粘附于管壁上.在反应体系配制完成后，将1μL显色液滴在管盖内侧，盖管盖时应小心，防止显色液混合进入反应液中.
