中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T4675.1-2016
出口葡萄酒中甘油的测定 酶法
Determination of glycerol in wine for export--Enzymatic method
前言
SN/T4675《出口葡萄酒质量安全分析方法》共分为30个部分：
SN/T4675.1出口葡萄酒中甘油的测定酶法；SN/T4675.2出口葡萄酒中2.3-丁二醇的测定气相色谱法；SN/T4675.4出口葡萄酒中乳酸的测定酶法： SN/T4675.5出口葡萄酒中有机酸的测定离子色谱法；SN/T4675.6出口葡萄酒中萄萄糖、果糖和蔗糖的测定；SN/T4675.7出口葡萄酒中乙醛的测定气相色谱-质谱法：SN/T4675.8出口葡萄酒中5-羟甲基糠醛的测定液相色谱法：-SN/T4675.9出口葡萄酒中二甘醇的测定气相色谱-质谱法；SN/T4675.10出口葡萄酒中曲霉毒素A的测定液相色谱-质谱/质谱法； SN/T4675.11出口葡萄酒中7种花色苷的测定超高效液相色谱法；SN/T4675.12出口葡萄酒中溶菌酶的测定液相色谱法；SN/T4675.13出口葡萄酒中2.4.6-三氯甲苯醚残留量的测定气相色谱-质谱法；SN/T4675.14出口葡萄酒中纳他霉素的测定液相色谱-质谱/质谱法：SN/T4675.15出口葡萄酒中水杨酸、脱氢乙酸和对氯苯甲酸的测定液相色谱法；SN/T4675.16出口葡萄酒中富马酸的测定液相色谱-质谱/质谱法；SN/T4675.17出口葡萄酒中丁基锡含量的测定气相色谱-质谱/质谱法； SN/T4675.18出口葡萄酒中二硫代氨基甲酸酯残留量的测定顶空气相色谱法：SN/T4675.19出口葡萄酒中钠、镁、钾、钙、铬、锰、铁、铜、锌、砷、晒、银、镉、铅的测定：SN/T4675.20出口葡萄酒中稀土元素的测定电感耦合等离子体质谱法：-SN/T4675.21出口葡萄酒中可溶性无机盐的测定离子色谱法：SN/T4675.22出口葡萄酒中总二氧化硫的测定比色法：SN/T4675.23出口葡萄酒及葡萄汁中氨氮的测定连续流动分析仪法； SN/T4675.24出口葡萄酒福林-肖卡指数的测定分光光度计法：SN/T4675.25出口葡萄酒颜色的测定CIE1976（Lab）色空间法；SN/T4675.26出口葡萄酒浊度的测定散射光法；SN/T4675.27出口葡萄酒碱性灰分的测定；SN/T4675.28出口葡萄酒细菌、霉菌及酵母的计数；-SN/T4675.29出口葡萄酒中酒香酵母检验实时荧光PCR法： SN/T4675.30出口葡萄酒中拜氏接合酵母检验实时荧光PCR法.
本部分为SN/T4765的第1部分.
本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本部分等同采用国际葡萄与葡萄酒组织（OIV）的方法OIV-MA-AS312-05《甘油》.本部分在技术内容上与该方法一致.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.
SN/T4675.1-2016
本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.
本部分起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、拜发分析系统销售有限公司、中华人民共和国新疆出入境检验检疫局.
本部分主要起草人：李志勇、刘青、刘朝霞、张子皓、谢锦锋、梁瑞婷、冯峰、张峰、廖冰君、陈瑜、王京、宦萍.
出口葡萄酒中甘油的测定酶法
1范围
SN/T4675的本部分规定了葡萄酒中甘油含量的酶法测定方法.
本部分适用于葡萄酒中甘油含量的测定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3方法原理
成甘油-3-磷酸和二磷酸腺苷（ADP） 葡萄酒中的甘油在甘油激酶（GK）的催化作用下甘油可与三磷酸服（ATP）进行磷酸化反应，生
反应（1）：甘油ATP 甘油-3-磷酸ADP
所生成的二磷酸腺苷（ADP）在丙酮酸激酶（PK）的作用下.被磷酸烯醇丙酮酸（PEP）转化成ATP，同时生成丙酮酸：
丙酮酸在乳酸脱氢酶（LDH）作用下.被还原剂烟酰胺腺嘌呤 二核苷酸（NADH）还原成乳酸：
反应（3）：丙酮酸NADHH →乳酸NAD
334nm、340nm或365nm处的衰域程度来测定. 在该反应过程中所生成的NAD的数量与甘油数量成正比 NADH的氧化程度是通过它在波长
将试样加水稀释，然后往比色皿依次加入缓冲液、反应液、试样稀释液和酶液进行反应，采用分光光度计测定吸光度变化，利用吸光度差值定量.
4试剂和材料
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，试验用水为GB/T6682规定的一级水.
4.1氢氧化钠（NaOH）.4.2 甘氨酰甘氨酸（CHNO）.4.4还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠（NADH）. 4.3 硫酸镁（MgSO7HO）.4.5 三磷酸腺苷（ATP）.4.6 磷酸烯醇丙酮酸（PEP）4.8丙酮酸激酶（PK）. 4.7 碳酸氢钠（NaHCO）
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4.9乳酸脱氢酶（LDH）.
4.10甘油激酶（GK）.
4.115mol/L氢氧化钠溶液：准确称取20g氢氧化钠，用水溶解并定容至100mL，转移至塑料瓶中.4.12缓冲溶液[0.75mol/L甘氨酰甘氨酸，c（Mg）=10-²mol/L pH=7.4]：将10.0g甘氨酰甘氨至100ml刻度. 酸和0.25g硫酸镁溶于约80mL水中，加入约2.4mL5mol/L的氢氧化钠溶液使pH值为7.4，再加水
4.13反应液[c（NADH）=8.2×10-²mol/L，c（ATP）=33×10-²mol/L c（PEP）=46×10-²mol/L]：准确称取42mg还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠（NADH），120mg三磷酸腺苷（ATP），60mg磷酸烯醇丙酮酸（PEP）和300mg碳酸氢钠溶解于6mL水中.
4.14丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶悬浮液[c（PK）=3mg/mL，c（LDH）=1mg/mL]：准确称取30mg丙酮酸激酶和10mg乳酸脱氢酶，用水溶解并定容至10ml.
4.15甘油激酶悬浮液[c（GK）=1mg/mL]：准确称取10mg甘油激酶，用水溶解并定容至10ml.
5仪器和设备
5.1分光光度计：能在波长340nm、334nm和365nm处进行检测.5.2玻璃比色Ⅲ或一次性比色Ⅲ：光程1cm.5.3超声波水浴.5.5分析天平：感量0.001g 5.4水平振荡器.
6测定步骤
6.1样品前处理
500mg/L，通常准确量取2mL试样（起泡酒需预先脱气），加水稀释至100mL，混匀，待测. 葡萄酒样品中的甘油一般稀释后直接进行测定.先用水将葡萄酒稀释，使甘油的含量为30mg/L~
6.2测定
在波长340nm，光程1cm的比色m中进行吸光度测定，用水做空白对照.在光程1cm的对照比色Ⅲ和样品比色Ⅲ中依次按表1分别加人试剂：
表1试剂加入顺序表
单位为毫升
顺序 试剂 对照 样品Ⅲ1 缓冲溶液（4.12） 1 00 1.002 反应液（4.13） 0.10 0.103 样品液 - 0.104 水 2 00 1.905 酶悬浮液（4.14) 0.01 10°0
将上述溶液混合，约5min后，读取对照溶液和测试样品溶液的吸光度A：.然后各加人甘油激酶悬浮液（4.15）0.01mL，混匀后，等待反应进行完毕（约5min~10min）后，读取对照溶液和测试样品溶液的吸光度A：.10min后再次读取吸光度，每2min检查一次，直至在2min内吸光度恒定为止.
