中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T4849.1-2017
出口食品及饮料中常见小浆果成分的 检测方法实时荧光PCR法 第1部分：蓝莓
Identification of the ingredients of mon small berry fruits food andjuice for export-Real-time PCR method-Part 1:Blueberry
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
SN/T4849（出口食品及饮料中常见小浆果成分的检测方法实时荧光PCR法》系列标准共分为6部分：
第1部分：蓝莓；一第3部分：黑加仑： 第2部分：树莓；第4部分：桑套：第5部分：蔓越莓和蓝莓：第6部分：猕桃.
本部分为SN/T4849的第1部分.
本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.本部分由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口.本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院.本部分主要起草人：陈颖、杨艳歌、吴亚君、邓婷婷、黄文胜、张九凯、韩建助、刘鸣畅、王斌.
出口食品及饮料中常见小浆果成分的 检测方法实时荧光PCR法 第1部分：蓝莓
1范围
本部分适用于鲜果、冷冻果、蜜饿、 鲜榨果汁、果肉型果汁、混浊汁、果干、果酱、及其他以蓝莓为原辅料的食品及饮料中蓝莓成分的定性检测（清汁及果酒除外）.本部分所规定方法的最低检出限（LOD） 为1%（体积比）.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T27403-2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测
GB/T27658-2011蓝莓
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件3.1.1
小浆果small berry fruits
浆果是指由一个子房或联合其他花器发育成的柔软多汁的肉质单果，由一个或几个心皮形成，小浆果则泛指果实较小、多汁的一类浆果.
3.1.2
蓝莓blucberry
圆扁形，并披一层白色果粉，果肉细腻，种子极小.拉丁学名：Vacciniumspp.，分为兔眼蓝莓 根据GB/T27658-2011描述，蓝莓是杜鸽花科越橘属植物中蓝果类型的果实，小浆果，近圆形或（Vaciniumuirgatum）、高丛蓝莓（VacciniumcorymbosamL）（分南高丛盐莓、北高丛蓝莓2种）、半高丛蓝莓（Vacciniumangustifolium×Vacciniumcorymbosum）、丛蓝莓（Vaccinium angustifolium）五个品种群.
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件.DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleic acid）
PCR；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）
SN/T 4849.1-2017
Ct值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonuleoside triphosphate）dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosine triphosphate）dCTP：脱氧胞苷三确酸（deoxycytidine triphosphate）dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosine triphosphate） dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate）UNG：尿喀啶N-糖基化酶（uracilN-glycosylase）CTAB：十六烷基三甲基澳化铵（cetyltrithylammoniumbromide）Tris：三羟甲基氨基甲烷[Tris（Hydroxymethyl）aminomethane]EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylene diaminetetraacetic acid）Taq：水生栖热菌（Thermusaquaticus） OD：光度密度（opticaldensity）
4方法提要
果实样品直接粉碎离心，果汁样品直接离心，提取沉淀DNA，果干、果酱、蜜饯先用蒸馏水清洗再提取DNA.以蓝莓果实为阳性对照，以其他水果DNA为阴性对照，无菌水作为空白对照.使用特异性引物探针进行实时荧光PCR扩增，通过实时荧光信号曲线判定是否存在蓝莓成分.
5试剂和材料
除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂.实验用水符合GB/T6682的要求.试剂均用无DNA酶污染的容器分装.
5.1检测用引物和探针：蓝莓成分扩增引物和探针、内参照（显花植物NADH基因）引物和探针详见表1.蓝莓引物扩增的靶标序列参见附录A.
表1蓝莓序列引物探针
扩增片段物种名称 引物/探针序列（5'→3'） 长度 靶基因F:GCTGAAGCAGCTACTTTCGAAGTAACA 138 bp NADH dehydrogenase内参照 P;FAM-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGAGG-BHQ1 R:AGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCA subunit B(mdhB)geneF AGCAACATGACGTCATATATCCACT蓝莓 RGAATACAAATTTGTATTGTACCCCA 244 bp maturase K(marK)geneP FAM-TGCACTTGCTCATGATCGTGGTTTAAATAGATT -TAMAR
5.2三氯甲烷（氯仿）. 5.3异丙醇.5.4CTAB提取缓液：20g/L CTAB，1.4 mol/L NaC1.0.1 mol/L Tris-HCl 0.02mol/L NaEDTA，pH 8.0.5.5CTAB沉淀液：5g/LCTAB，40mmol/LNaCl.5.670%乙醇（体积分数）.
5.7NaCl溶液（1.2mol/L).5.8蛋白酶K（20mg/mL）.5.9实时荧光PCR反应混合液：12.5μL反应体系包括：1U~2U（Unit，酶学单位）的Taq醇、1×PCRbuffer、2.5mmol/L~4.0mmol/L的Mg、0.2U~1U的UNG、0.2mmol/L的d（A，C.G)5.1010×PCR缓冲液：200mmol/L Tris-HC1(pH 8.4） 200mmol/LKCl 15mmol/L MgCl. TPs、0.2mmol/L~0.4mmol/LdUTP、400 nmol/LROX染料.
6收器设备
6.3恒温水浴锅. 6.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计.6.4离心机：离心力≥12000g6.5微量移液器：0.5μL~10pL，10μL~100μL 20 μL~200μL，200μL~1000μL.6.6粉碎装置.6.7涡旋震荡器. 6.8pH计.6.9量筒：容量50mL.6.10烘箱.
6.1实时荧光PCR仪.
7检测步骤
7.1样品前处理
鲜果、冷冻果样品直接粉碎，6000r/min离心，取沉淀物部分.果干、果酱、蜜饯类样品先用蒸罐水浸泡清洗3次，再粉碎.果汁样品取适量15000r/min离心30min，取沉淀部分.
7.2DNA提取
取50mg~500mg样品，加人1mLCTAB提取缓冲液，同时加人0.01倍体积的20mg/mL蛋白酶K，65C温育1h~2h，期间不时震荡混匀，应保证样品自由悬浮于液体中，必要时再加人适量CTAB提取缓冲液；取出后12000r/min离心10min，转移上清至2mL离心管中，加人0.7倍体积的0.7倍体积的三氧甲烷，剧烈震荡混匀，室温下12000r/min离心10min：转移上清至干净离心管中.加 三氯甲烷，剧烈震荡混匀，12000r/min转速下离心10min；转移上清至另一灭菌的离心管中，再加人1.2mol/LNaCI溶液，充分溶解沉淀：加人0.8倍体积的异丙醇或2倍体积一20C冰箱中预冷的无水乙醇混匀，一20C放置30min.12000r/min4℃离心10min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000g4℃离心10min，弃上清，室温下晾干.加人50μL~100μL双蒸水，室温10min，混匀，-20℃ 保存.
上述模板DNA均可用等效DNA提取试剂盒提取.
7.3DNA浓度和纯度的测定
使用核酸蛋白分析仅或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值Am和A，
