中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 4849.5-2017
出口食品及饮料中常见小浆果成分的 检测方法实时荧光PCR法 第5部分：蔓越莓和蓝莓
Identification of theingredientsof mon small berry fruitsin food and juice for export-Real-time PCRmethodPart5:Cranberry/blueberry
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
SN/T4849（出口食品及饮料中常见小浆果成分的检测方法实时荧光PCR法》系列标准共分为6部分：
第1部分：蓝莓：第2部分：树莓； 第3部分：黑加仑；第4部分：桑葚；第5部分：蔓越莓和蓝莓；一第6部分：猕猴桃.
本部分为SN/T4849的第5部分.
SN/T 4849.52017
出口食品及饮料中常见小浆果成分的 检测方法实时荧光PCR法
第5部分：蔓越莓和蓝莓
1范围
SN/T4849的本部分规定了出口食品及饮料中蔓越莓和蓝莓成分的检测方法实时荧光PCR法.
本部分适用于鲜果、冷冻果、蜜饯、鲜榨果汁、果肉型果汁、混浊汁、果干、果酱、及其他以蔓越莓和蓝莓为原辅料的食品及饮料中蔓越莓和蓝莓成分的定性检测（清汁及果酒除外），本部分所规定方法的最 低检出限（LOD）为1%（体积比）.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403-2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测
GB/T27658-2011蓝莓
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3.1.1
小浆果smallberryfruits
浆果是指由一个子房或联合其他花器发育成的柔软多汁的肉质单果，由一个或几个心皮形成.小浆果则泛指果实较小、多汁的一类浆果.
3.1.2
蔓越莓cranberry
杜鹃花科越橘属红莓苔子亚属，一种表皮及果肉都是鲜红色的圆形小浆果的俗称，别名：蔓越橘、小红莓，酸果蔓、蔓越梅、鹤莓.拉丁学名：Oxycoccos.分为大果红莓苔子（美洲蔓越橘）（Vacciniummac-rocarpon），小果红莓苔子（毛蒿豆）（Vacciniummicrocarpum），红莓苔子（北方蔓越橘）（Vacciniumoxycoccux），红果扇枝越橘（南方蔓越橘）（Vacciniumerythrocarpum）4个品种群.
3.1.3
蓝莓blueberry
根据GB/T27658-2011描述，蓝莓是杜鹏花科越橘属植物中蓝果类型的果实，小浆果，近圆形或圆扁tum）、高丛蓝莓（VacciniumcorymbosumL）（分：南高丛蓝莓、北高丛蓝莓）、半高丛蓝莓（Vaccinium angus- 形，并披一层白色果粉，果肉细腻，种子极小.拉丁学名：Vaccinimspp.，分为兔眼蓝莓（Vacciniumirga-
ifolim×Vaccinium corymbosum）、矮丛蓝莓（Vaccinim angusifolim）五个品种群.
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件.
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）.PCR：聚合酶链式反应（polymerase chainreaction）.C值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数.dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonuleoside triphosphate）dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosine triphosphate）. dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deodGTP：脱氧鸟苷三磷酸 (deoxyguanosine triphosphate). adin triphcdTTP：脱氧胸苷三磷酸 (deoxythymidine triphosphate).UNG：尿喀啶N-糖基化酶（uracil N-glycosylase).CTAB：十六烷基三甲基澳化铵（cetyltrithylammonium Tris：三羟甲基氨基甲烷[Tris（Hydroxymethylaminomethane]. bromide).EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylene diaminetetracetic acid）.Taq：水生栖热菌（Thermus aqwaricus).OD：光度密度（optical density）.
4方法提要
果实样品直接粉碎离心，果汁样品直接离心，提取沉淀DNA，果干、果酱、蜜饯先用蒸馏水清洗再提取DNA.以蔓越莓或蓝莓果实为阳性对照，以其他水果DNA为阴性对照，无菌水作为空白对照.使用特异性引物进行实时荧光PCR扩增，通过实时荧光信号曲线判定是否存在蔓越莓或蓝莓成分.
5试剂和材料
除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂实验用水符合GB/T6682的要求.试剂均用无DNA酶污染的容器分装
5.1检测用引物和探针：蔓越莓和蓝莓成分扩增引物和探针、内参照（显花植物NADH基因）引物和探针详见表1.蔓越莓和蓝莓扩增靶标序列参见附录A.
表1蔓越莓和蓝莓序列引物探针
物种名称 引物/探针序列（5→3'） 扩增片 段长度 靶基因F;GCTGAAGCAGCTACTTTCGAAGTAACA内参照 R;AGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCA 138 bp NADH dehydrogenase subunit B(ndhB)geneP;FAM-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGAGG-BHQ1F;CATTTTAGCTTCAAATGGTTCGTCT matursse K(marK)蔓越莓和 蓝莓 R;TGAGTCCGTACCATTGAAGGTTTTA 192 bp geneP:FAM-ACGCTTGAAAGATAGCCCAGAAAGTCGAA-TAMAR
SN/T 4849.5-2017
5.2三氯甲烷（氯仿）.
5.3异丙醇，
5.4 CTAB 提取缓冲液:20 g/L CTAB 1.4 mol/L NaC1 0.1 mol/L Tris-HC1 0.02 mol/L NaEDTA pH 8.0.
5.5CTAB沉淀液：5 g/L CTAB，40mmol/LNaCl.
5.670%乙醇（体积分数）.
5.7NaCl溶液（1.2mol/L).
5.8蛋白酶K（20mg/mL）.
5.9实时荧光PCR反应混合液：12.5μL反应体系包括：1U~2U（Unit，酶学单位）的Tag酶、1× PCR buffer、2.5mmol/L~4.0 mmol/L 的 Mg²0.2 U~1 U 的 UNG酶、0.2 mmol/L 的 d(A C G)TPs.0.2mmol/L~0.4mmol/LdUTP.400nmol/LROX染料.
5.1010×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4）.200mmol/LKCl.15mmol/LMgCl.
6仪器设备
6.1实时荧光PCR仪.
6.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计.
6.3恒温水浴锅.
6.4离心机：离心力≥12000
6.5微量移液器；0.5pL~10L10pl~100μL.20L~200pL，200pL~1000pl.
6.6粉碎装置.
6.7涡旋震荡器.
6.8pH计.
6.9量筒：容量50ml.
6.10烘箱.
7检测步骤
7.1样品前处理
鲜果、冷冻果样品直接粉碎，6000r/min离心，取沉淀物部分果干、果酱、蜜饿类样品先用蒸馏水浸泡清洗3次，再粉碎.果汁样品取适量15000r/min离心30min，取沉淀部分.
7.2DNA提取
取50mg~500mg样品，加人1mLCTAB提取缓冲液，同时加人0.01倍体积的20mg/mL蛋白酶K，65C温育1h~2h，期间不时震荡混匀，应保证样品自由悬浮于液体中，必要时再加人适量CTAB提取缓冲液；取出后12000r/min离心10min，转移上清至2mL离心管中，加人0.7倍体积的三倍体积的三氯甲烷，剧烈震荡混匀，室温下12000r/min离心10min：转移上清至干净离心管中，加人 氯甲烷，剧烈震荡混匀，12000r/min转速下离心10min；转移上清至另一灭菌的离心管中，再加人0.7等体积的CTAB沉淀液混匀，室温沉淀1h；13000r/min的转速离心10min；弃上清，加人350pL1.2mol/LNaCl溶液，充分溶解沉淀：加人0.8倍体积的异丙醇或2倍体积-20C冰箱中预冷的无水乙12000g4C离心10min，弃上清，室温下晾干.加人50μL~100μL双蒸水，室温10min，混匀， 醇混匀，-20C放置30min，12000r/min4C离心10min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，
