中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 4892-2017
出口动物源性食品中雌二醇、睾酮和孕酮 残留量及稳定碳同位素比值的测定
Determination ofresidues and stable carbon isotope ratio of estradiol testosteroneand progesterone in foodstuff of animal origin for export
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.
本标准起草单位：深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：肖陈贵、岳振峰、赵超敏、康海宁、肖锋、林黎、张毅、韩瑞阳、侯乐锡.
出口动物源性食品中雌二醇、辜酮和孕酮 残留量及稳定碳同位素比值的测定
1范围
本标准第一法液相色谱申联质谱法规定了动物源性食品中睾酮、孕酮、a-雌二醇、β-雌二醇残留量的高效液相色谱-串联质谱测定和确证方法.第二法气相色谱/燃烧炉/间位素比值质谱法规定了动物源性食品中雌二醇、睾酮和孕酮的稳定碳同位素比值测定的气相色谱/燃烧炉/同位素比值质谱方法.
本标准第一法液相色谱申联质谱法适用于动物源性食品牛肉、牛奶、鸡肉中睾酮、孕酮、雌二醇残留量的测定.第二法气相色谱/燃烧炉/同位素比值质谱法适用于动物源性食品牛肉、牛奶、鸡肉中残留雄二醇、睾酮和孕酮（残留水平>10μg/kg）的稳定碳同位素比值的测定.
2规范性引用文件
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GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
第一法 液相色谱串联质谱法
3方法原理
以乙酸乙酯和乙睛提取，样品提取液以QuEChERS吸附剂净化.浓缩后以高效液相色谱-质谱/质谱仪测定，内标法或外标法定量.
4试剂材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1乙睛：色谱纯.4.2甲酸：色谱纯.4.3冰乙酸，色谱级，4.4乙酸铵：色谱纯.4.5N-丙基乙二胺吸附剂（PSA），40μm~60μm粒径范围，100A平均孔径. 4.6十八烷基键合硅胶吸附剂（C18-封端）.40μm~60μm粒径范围，60A平均孔径.4.7无水硫酸镁，分析纯，500C灼烧4h，置于干燥器中备用.4.8β葡糖苷醛式酶-芳基硫酸酯酶，含P-盐酸葡萄糖醛式酶134600U/mL，芳基硫酸酯酶5200U/mL.4.9乙酸铵缓冲溶液：溶解7.7g乙酸铵（4.4）于480mL水中，用冰乙酸（4.3）调节溶液pH值到5.2，以
水定容至500ml.
SN/T 4892-2017
4.10QuEChERS吸附剂：准确称取100mgPSA（4.5）、40mgC18（4.6）和400mg无水硫酸镁（4.7），储存于25mL具螺旋盖聚丙烯离心管中，旋紧管盖，置于干燥箱内备用.4.11标准物质：睾酮、孕酮、179-雌二醇、17α-雌二醇标准物质的纯度均≥99%，参见附录A表A.1.4.122.3，4-C13-睾酮、D9-孕酮、D2-9-雄二醇标准物质的纯度均≥95%，4.13标准贮备液：准确称取10.0mg按其纯度折算为100%质量的各个化合物的标准物质（4.11），甲4.14标准中间溶液：准确吸取1.0mL各标准贮备溶液（4.13），以甲醇稀释并定容于100mL棕色容量 醇溶解定容至10.0mL，溶液浓度相当于100.0mg/L，-30C冷冻保存，有效期为12个月.瓶，浓度相当于1.0mg/L.4℃冷藏保存，有效期为6个月.4.15空白基质溶液：选取不含待测物的样品，按照7.1和7.2步骤操作，得到空白基质溶液，4.16基质混合标准溶液：根据需要用空白基质溶液（4.15）稀释标准中间溶液（4.14）成适合浓度的混合标准工作溶液，现配现用. 4.17内标贮备液：准确称取10.0mg按其纯度折算为100%质量的内标标准物质（4.12）.以甲醇溶解并定容于10mL棕色容量瓶，浓度相当于100.0mg/L，一30C冷冻保存，有效期为12个月.4.18内标中间溶液：准确吸取1mL各内标贮备溶液（4.17），以甲醇稀释并定容于100mL棕色容量瓶，浓度相当于1.0mg/L，4C冷藏保存，有效期为6个月.4.19内标工作液：根据需要用空白基质溶液（4.15）稀释内标中间溶液（4.18）成合适浓度的标准内标工 作溶液，现配现用.4.20微孔滤膜：0.22μm，水相和有机相型.
5仪器和设备
5.1高效液相色谱四级杆质谱/质谱仪：配有电喷雾离子源.5.2电子分析天平：感量0.1mg.0.01g.5.3减压旋转蒸发仪.5.4旋满混合器.5.5高速冷冻离心机：最大转速为10000r/min 5.6微量移液器：量程10μL~100l 100μL~1000μL.5.7pH计.5.8螺旋盖聚丙烯离心试管，50ml.5.9组织捣碎机.5.11平板振荡器. 5.10恒温水浴振荡器.
6试样制备与保存
6.1牛肉、鸡肉
取代表性样品1000g，应尽量避免取脂肪部分，用组织碎机充分粉碎均匀，均分成两份，分别装人洁净容器中，密封，并标明标记，于一18C保存.
6.2牛奶
取代表性样品1000mL，充分摇匀，均分成两份，分别装人洁净容器中，密封，并标明标记，于4℃保存，
7测定步骤
7.1样品提取
7.1.1酶解
称取试样2g（精确到0.01g），置于50mL具螺旋盖聚丙烯离心管中，准确加人20pL内标工作液酸酯酶（4.8），涡旋混匀30s，37C振荡温育12h. （4.19），加人8mL乙酸铵缓冲液（4.9），在均质器中高速均质30s.加人30pLβ-葡糖苷醛试酶-芳基硫
7.1.2提取
取出样品静置至温度降至室温.加人5.0g无水氯化钠、5mL乙酸乙酯和5mL乙晴（4.1）.涡旋混匀1min后，在4℃、9500r/min离心5min，收集上清液于另一50mL离心管.剩余部分重新加人 10mL乙溶液，旋紧螺旋盖，室温下平置于水平振荡器，振荡提取10min，在4℃、9500r/min离心5min，吸取上清液层溶液，合并两次提取有机相，待净化.
7.2净化
将上述样品提取液涡旋1min，静置后移取其中10mL至另一15mL离心管.一次性将QuECh-ERS吸附剂（4.10）加人样品提取液中，旋紧螺族盖，高速涡旋1min，在4C、9500r/min离心5min.吸取有机相溶液，40C氮气吹至近干.加人乙晴-水溶液（2：8）溶解残渣并定容于1.0mL，涡旅混合1min，过0.22pm滤膜（4.20）.滤液供液相色谱-质谱/质谱仪测定.
7.3测定
液相色谱条件如下：
a）色谱柱：XDB-C柱，100mmX2.1mm（内径），粒径3.0μm或相当者.b）流动相：A：水；B：乙睛. c）流速：250μL/min.d）柱温：35℃.e）进样量：10μL.f）梯度洗脱程序见表1.
表1液相色谱梯度洗脱程序表
时间/min A/% B/%0.00 80 0 20.08.00 30 0 70.09.00 10.0 90 013 00 10.0 90 013.10 80.0 20.017 00 80 0 20.0
7.4质谱条件
质诺条件如下：
