中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 1181 2-2003
Detection antibodies against foot and mouth disease virus-- Protocol of micre-serum neutralization test
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标据采照O4EX非新试验与疫资标准手册12000年第四版2.1.1章的相关内客起草本标维的附录A.财录B是标准的资料性附录. 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并街口.本标维起草单位：中华人民共和国珠尊出人境检验检疫局. 本标准主委平人，标素，非景山、昌宏，两家望，本标准系首次发布的检验检疫行业标准.
口路疫病毒抗体检测方法微量血清中和试验
1范图
本存车现定了口四交我毒量建血消中和试独方齿本标掌运用于口部疫病毒中和航体水平的检测.
2规竞性引周文件
下列文件中的条款通过本标建的引用面成为本标准的条款，凡是注日期的引用文件.其随后的修改单（不包担物误的内容）减修订版均不适用于本标查-然间，跟助根据本都准达成助议的各方研究 是否可使用这叁文师的最新版本，凡是不性日期的引用文件，其最新版本通用于本标准，
3综略浴
下列笔略活道用于本标准，3.13.2 致维购病变作用.YCID 3.3FMD 口海疫.
4原
是，这一反应不组表现为一种病毒只能被相应的党疫血清质中和，两且还囊民在中和一定量的病看，必 特持性的血清中和抗体与病毒结合后、使病毒失去对敏感细脑的感录能力.员百阳止病毒的繁集毒50%致细账病变能力时，其准增的解称度甲为其效价.因而本中和试验是一种定量预定口疫生 领有一定效价的免疫血清，本标率规定的中和试验是以定量病毒机释自为基础，当重请座阻止定量请祝体的方齿.
5试到和时料
5.1本标冻所用水应行合GB/T6682-1992中关于三级水（三蒸水）的航垫.5.3本标座试则障特殊规定外，均指分析试到. 5.2本标度所用试配方参见附录A5.4本标准所阳试剂、孩聘添正有特殊视定外，均需高压灭街. 5.5病毒选用经险现线化井经盘情李蔓定的O.A.C、SATSAT、SAT，相Ail型口端疫朝胞毒分到作为各型生确抗体检洲的标查毒.
SN/T 1181.2-2003
5.6标准血济：标准用性血清采用无口局疫病毒抗体的指血清或牛业清，标准阳性虚清采用口障疫病 尊感免发疾21d的康发站血义牛业调.
5.7朝路系IB-R2或BHK-21期胞系
5.8组胞增养基：含10%无口即疫病毒抗体的输牛血盾（经54℃，30min灭能）及抗生累的细脂培
5.9理维特技：含2%无口罪疫病毒抗体的胎牛血携（经56C，30n灭能）及抗生家的期压培
5.10级胞分散：
5. 11国定推的配制-10%甲图（900mL生理盐水100mL甲脂）.
5. 12染色兼的配新：1 000mL固定糖0.5g亚甲蓝.
6卷和设备
6.1二氧化碳培养箱、票量拆历器、闽置是录键、冰验（一20℃保存业辨.一70C保存种毒）.6.2100mL细胞培费瓶、96孔微量娅胞培养板、吸头、多道可调移液器.单道可调移液委.
7别备试额
7. 1将口腾疫病毒O A C、SAT 、SAT、SAT 和Asal童分别胰种IB-Rs-2 减 BHK-21细胞单层，37°℃吸附1h后加人地持被，量5%二氧化碳培费箱于37C培养-接神24h后用例置是微健逐日现账， 待CPE达75%以上-冻融一次成置水指中用题产狼处理（40uA 1min） 2000r/min离心20min.上清被分装小属-母航1mL.置一70C保存备用.
7.2病毒毒价的剂定及其工作浓度的配制：将府毒面推同缓胞维持液做10倍系列释至10-”.每个稀实作4个孔，每孔50μL每孔加50pL组图进液（含10°个级胞/mL).再补充里的维册硬50y 每块板设4孔正常细愿对烈，于5%二氧化碳培养箱37C地养.月48h开始至166h用例量显做镜逐日现察记级CPE披Karer方陆计算TCIDu，将病毒原服起制成300TCID/50μL.特用.
7.3将标准网性血清、明性血清、被检血清经S6℃30min灭能-异用.
7.4将细胞用准胞地养成等释成10个细胞/mL，待用.
9中和试秘
8.1对除设立
8.1.1细路对现：记《孔正细胞对烈，每孔加细脂量液50L（含10个细胞/mL).细胞维液100 xL
8.1.2阳性对别：将已如演虚的标准阳性血清用细胞难持液在0孔微量培养板上月1：4开始做对倍系列解样，每个种区作4个孔.年孔加各样帮实附性盘销和100TCID/0病寄热推各50.贷 量援实器报医据匀，置37℃中程1h.再加人级医是液50μ（含10个组图/mL).
8.1.3明性对账，设4在明性盘请对洲.每孔L加时性血准和100TCD/50x1.病毒费液各50μ1.高加 入组s量液 50 μ1(含 10* 个样基/=L)
8.1.4病毒网由对限，将各型病毒解那为1000 100.10 1TCID/50xL.每个稀帮度作4孔，每孔加 人病毒基液 50 μl 再加人细的悬成 50 μL(含 10* 个指图/m1.) 毒孔补充期胞准持液 50 y.
8.1.5血清毒性对照：被检血资每个孵释度设1孔血情毒性对期，即50p1.各释降度血清.补充59×1 推持减 再加入组脂盘藏 50 pL(含 10 个组胞/mL)
8.2试验步额
得待枪业济用娱脂增特液在张量养板上头14开始做对锁系列裤押，每个希样度作5礼，每孔50xL 被检秤每个样静度4孔排人预备试检真定好工度的病毒波100TCIDg/50pL微显振 2
的培费箱中37℃培育2d~34.48h用倒置显数镜初判.72h是判，终判抗带固定染色.
8.3持判定的固定染色
冲洗：乳察结果、 去地费基，每孔加50pL圆定核，置定30min.齐去固定液，将板授人染色减中30min，自案水
8.4随果判定
8.4.1结果判定需以对所成立为前提，当病国归为g1.5～1g.5，标准阳雀自增效价与原摘定缴价相差1个滴度以内，参考的性血清对照孔为空自，胞对经孔细愿乘成建色时，才能进行些判.
8.4.2细能显染成蓝色的孔判为阳性，组胞服为空自时判为别性，血请效价以50为终点症清与病靠合中业的总希释度表示.
FMD参考实验室提供的标准试制做非考来建立自已的标准，世界参考实验室的列定标准参见附录B
