中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T4808-2017
Detection of sulfonamide residues in live animals and feeds for import andexportEnzyme linked immunosorbent assay method
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口. 本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局.本标准主要起草人：同超杰、姚佳、张旭东、苏明明、肖姆娜、孙剑、丁艳、刘芳伊.
进出口食用动物、饲料中磺胺类 药物的测定酶联免疫吸附法
1范围
本标准规定了进出口食用动物的血清、尿液及饲料中九种磺胺类药物残留量的酶联免疫测定方法.
啉、磺胶对甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胶甲噻二唑、磺胺氯哒嗪9种磺胺类药物总量的 本标准适用于禽类和畜类血清、畜类尿液及饲料中磺胺甲恶唑、磺胺吡啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺唑恶测定.本标准仅适用于出入境检验检疫工作.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3方法原理与提要
采用竞争性酶联反应原理，微孔板上包被着抗磺胺类药物抗体的捕获抗体.磺胺类药物标准品或者样品溶液、HRP标记的磺胺类药物和抗磺胺类药物抗体添加到孔中.游离的磺胺类药物和HRP标记的磺胺类药物竞争结合磺胺类药物抗体，同时板上包被捕获抗体被抑制.没有结合的HRP标记的磺胺类药物在洗板步骤中被洗去.TMB底物加人板孔中，底物的颜色显色强度与样品中磺胺类药物的含量成反比.
4试剂和材料
除另有规定外，试剂均为分析纯，或为更高级别，水为GB/T6682规定的二级水，
4.1磺胺类药物多残留快速检测试剂盒，试剂盒应在4℃C~8℃条件下避光保存.
4.1.196孔酶标板（可拆式）.4.1.2HRP偶联磺胺类药物.4.1.3抗体工作液.4.1.4TMB底物溶液. 4.1.5反应终止液.4.1.610×样品提取液F：使用时按1：9的比例用蒸馏水稀释成1×样品提取液F.4.1.720×浓缩洗液：使用时按1：19的比例用蒸馏水稀释成1×工作洗液.4.1.8组织提取液：将浓缩组织提取液加人180mL蒸馏水，混匀完全溶解后即为组织提取液.4.1.9组织纯化试剂.
SN/T 4808-2017
4.2甲醇.
4.3乙睛.
4.4磷酸氢二钠（NaHPO12HO）.
4.5磷酸二氢钾（KHPO）.
4.6氯化钠.
4.8标准品：包括磺胺甲恶唑、磺胺吡啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺喹恶啉、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺间二甲氧嗜啶、磺胺甲噻二唑、磺胺氯哒嗪九种标准品，纯度≥99%.参见附录A.
4.9标准品储备溶液：将磺胺药物标准品配制成10mg/L.甲醇储备溶液，一20C保存，有效期6个月. 4.100.01mol/L磷酸盐（PBS）缓冲溶液（pH-7.4）：称取8.0gNaC1.0.2gKCI.0.24gKHPO，和3.63gNaHPO，溶于800mL蒸馏水中，用HCI调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1 L.冰箱4℃保存.
5仪器和设备
5.2均质器.5.6水浴氮吹仪.5.9单道微量加样器：20μL，100L.200 5.8洗板机.5.10多通道微量加样器：200
5.1粉碎机.
5.3天平（精确到0.001g）.
5.4激涡混合器.
5.5离心机（3000×g以上）.
5.7酵标仪：测定波长450nm.
6测定步骤
6.1试样制备和保存
6.1.1试样制备
匀，将样品分成两等份，装人洁净容器内，作为试样密封并标明标记，血液样本在保存前应制备成血. 分别取食用活动物的血液100mL.新鲜尿液样品约500g或500mL，均质饲料样品500g，充分混清，全血样本置于室温放置2h或4C过夜后大于3000r/min离心10min，取上清液即为血清.
6.1.2试样保存
将试样于-18℃以下冷冻保存，在制样操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化.
6.2提取
6.2.1饲料
称取1.0g（精确到0.01g）均质饲料样品，加人6mL乙晴和2mL组织提取液，最大速度涡振荡3min，4000r/min以上离心10min：移取3mL上清液到干净的离心管中，加人150mg组织纯化试
剂，涡旋振荡30s，室温下静置5min，4000r/min以上离心10min：移取600pL上清液到干净离心管 中，50℃~60C水浴氮气吹干，加人500μL1×样品提取液F，涡旋振荡30s，每孔取50pL用于检测.
6.2.2血清
取0.5mL血清到离心管中，4000r/min以上离心10min，取20μL上清液，加人80pL1×样品提取液F，混匀稀释后每孔取50μL用于检测.
6.2.3尿液
取0.5mL尿流到离心管中，4000r/min以上离心10min，取20μL上清液，加人80gL1×样品提取液F，混匀稀释后每孔取50μL用于检测.
6.3酶联免疫测定
6.3.1标准曲线的制备
用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释10mg/L.的磺胺药物标准溶液贮备液至100μg/L，用PBS对100μg/L的磺胺药物标准溶液进行梯度稀释，得到一系列不同浓度的磺胺药物标准溶液（50μg/L，20μg/L.15μg/L.5.0μg/L 1.5μg/0 5μg/L）.
6.3.2样品测定
在酶标板设定的孔中分别加人0不同浓度的磺鞍药物标准溶派和样品待测液：在空白和对照胺药物抗体；空白孔中则加人100pL磷酸盐缓冲液：轻拍混匀，用粘胶纸封住微孔以防溶液挥发，室温孵育60min，弃掉醇标板中的液体用洗液洗板3次，每次每孔应加人250pL1×工作洗液.加人100pLTMB底物，轻轻混匀，室温效置30mmin后，每个孔加人100gl.的反应终止液终止反应，轻轻混 匀，稳定2min后，10min内在450nm下读出每几吸光值.
6.3.3空白试验
除不加试样外，均按上述测定步骤进行.
6.3.4质控试验
每次测定均应用空白试验、阴性样品和阳性样品作为对照进行质量控制，阳性样品的添加浓度应为相应样品的定量限.
6.4结果计算
6.4.1百分吸光度值的计算
按式（1）计算百分吸光度值：
式中：
B一样品孔的平均吸光度值：Be--空白孔的平均吸光度值；B.--零标准的平均吸光度值.
