中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 1200-2003
Protocol of qualitative PCR for the detection of geneticallymodified ponents in tobacco
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附条A是资料性附录. 本标座由国家认证认可监督管理委员会现出并目口.本标推起享单位，中华人民共和国云南出人境检验检疫局， 本标准主要起单人，徐自患、贺建军，民税馨、且有民、周方民.本标准系首次发布的检验检疫行业标准.
烟草中转基因或分定性PCR检测方法
1瓦图
本杯准规定了级草中转基因成分定性PCR检厕方法.本标度运用于划新等和干的细叶、种料及得级等的转基器成分进行定性检剂和鉴定.
2规范性到用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用用成为本标准的条款，儿品注目期的引用文件，其笔后新有的修改单（不包括能误的内客）或修订版均不道用于本标准、携阅，载酬根据本标准达减协议的各方研究是否可使用这使文件的量新服本，凡是不注日期的引用文件，其最新级本通用于本标准，
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T1193基因验测实验室术要求SN/T1204物及其排工产品中转基因成分实时荧元PCR定性检独方法
3水请.定文和蹈明请
下列术语、定文和缩略逐适用于本标准.
3.1末语和定义
3. 1. 1
特基因trne
将物种本身不具有的、来源于其他物种的功能DNA序列，通过各种导入手段，使其在该物种中进行表达，以便试物种疾得新的品种特征.
3. 1.2
聚合值式反皮pomerase cainreectien.找称PCR
模板基四序列先经高围变性成为单链在DNA聚合酮作用和运宜的反度条件下.根强槟版序兴设计的两条引物分别与模析DNA两条情上相定的一最工补序列发生逐火面相互填合-接看在DNA聚合 确的作用下以民种服氧核提核酸（4NTPs）为底物，健引物得以神然后不断重复生性、退火和运件这一猫环，使次扩理的基因片程以儿柯细数理证.
3.2明略
3. 2. 2 EDTA ethylene diaminetetmacetic acid 乙二股图乙股 3.2. 1UNG;uratil DNA glycosylase 区电g DNA-物基册 3.2.3CTAB，十六伙基三乙基顶化情， 3.2. 4TMV-CP;tobacco mosiac virua coat protain 期草叶病海外亮蛋白基因 3. 2. 6TMV-54KD;tobecco mosier virus S4KD grme 華花叶病每 54KD亚白基 3. 2. 5CMV-CPcecumber mosiac vires coat protain 黄后花a病毒外亮蛋白基因 3.2.7BT：Beies Theiegeis s办sp苏云金图杀皮蛋白基图. 3. 28PVY-CP.potato vires Yeoat proten.马转著病毒Y外光董白基因3.29TEE;Tris碱 磁肤 EDTA缓冲液 3. 2.10NPT-II -neomycin-3’-phosphotrensferase gene 薪等素-3’-调能转移输基四3. 2.11NO5 teeminasor of sopaine xyebase gent.服联城合皮路基因终止子. 3. 2. 12CaMV 35S 35S promoter from ctuliflower moseic virus 来自于花椰案花叶案番的 35S B
子.
3.2.14DNA，deoxyriboucleic ecid，股氧技糖股， 3.2. 13Tria，tzis （bydroaymethyl) ainomethane，三（短甲基）氨虽甲烧 3.2. 15 4NTPs 4TTP 4ATP 4CTP dGTP 3. 2. 16dTTP;deoxyribonucleoside triphosphate-脱氧美董=确.3.2. 17dATF;deonyademsine triphosphate，既氧腺甘三需般. 3.2. 18dCTP;deoxycytidine triphosphate.脱氧B世三确股 3.2. 19dGTP deoxyguanosine triphosphate 聚氧鸟骨三最酸 3.2.20dUTP.deoxyeridine triphosphese.股氧伊三确3.2.21bp:bsse pair 孩基对
4原理
转基因植物是经过了基因修物的植物习其本费的基因组中有外器基四的导人其基四通中含有外图成分，转基因物是为了使植物获得抗用、杭失，抗除尊到，民商你物品质、产量导性状，所以在进行 物的若基因改造时，核物中必须导人能够表达上述性状的目的基因，同时要在植物中表达达些外漂目的基因还需个完整的表达调控系统，其中主要包桥启动子，终止子以及在构建和鉴定表达系统所 的选祥标记基器，对转基因植物的检到主要通过检测调推伴列自动子、账止子，选择标记基因进行树适排标 S2基因 NPT-I1 ：案 见育品 化级事 B的 基四有 TMV-CP CMV-CP TMV-54KD BT PVY-CP
5防污染措地
防企交又行鼎的措施照SN/T119中的载定执行.
6试剂和材料
6.1本标准所用水应智合GB/T6682中三级水（三英水）的规格. E.2下列试剂除特味规定外，均费分析纯试剂.6.2.1化、三氧甲烷、界成醇、CTAB、液氮、EDTA、Tis.硼酸、B-孩签乙酵. 6.2.2NTP.TaQDNA聚合酶.m脂，溪化乙键、DNA分子盘标准、电涨载样班冲液.6.3雾技普酸引物（见表1），
表！检测转基四信京内、外源基回所需引物序列表
5'-gcinstaestgmetc-?' 引物序列 扩理所段长度355 5"-gatagagogungio-]” 191bpNOS 1'-grongugcmtg-3” S'-uroctagmgergte-]° 180%SPT-I t'-eprecrtgate-3′ 173%B 5'-cenacugraaraamguvgge1 299% 验定检州S'rgpmpttgprtgagp-3” 1'-gigggcagmggng-3'CKV-CP 5′-ctogatgarienirgaa-] t02h 董定剂
1（续）
检测基器 基因东源 1'-gsattotacgteo-3' 引物序到 扩地片我长度 提示42-AAd 外源 5'gcataooggrte’ si2bp 定检院TMV S4KD 5'-gaggrarremp-!' 5'-sastggcsangccge4-3” 2Hiph 基定检图ANI 外医 5egmgmmgrege! 5"-raccggagpgpictarunacg-3” ste 定检测ou mf 5"-gae3”coading DNA
7 主要器械和设备
7.4微量高速离心机，
7.6新胶成像系统，
7.10真空干燥机
7. 12各式微量移液器(0.5 pl ~1 000 yL)-各式他头（100 μL~1 000 μl)-各式微量离心管（250 pL~1 500 pL) 研
8祥品处理
8.1取样
按账5N/T1194中规笔的方获进行.
8.2制样
内.置27T~28℃培养箱）试干级叶，还有国性和阳性对照通约200mg置于经真压灭菌销毒的研修 将持检样品新鲜细叶，细杆在提纸上生长发芽的激芽（将烟籽置有用自来水湿得的健纸的培养里内，北样应至少平行放二至三份，用费刀尽量期碎，姓后加人道量减駕，品速进行研-使叶片成粉状.
8.3DNA的提取
8.3.1在到取样品DNA的同时-要设立竞白对洲.即取民样量的三蒸水，也进行DNA提取.
8.3.2阳和新赞烟叶中DNA的取.
8.3.2.1将前步中新细叶或细唯芽经研塞后的的末转移到1.5m1真心管中.然后胶1xL/mg人65C预然的2×CTAB挂提缓冲象（配别费兄附录A）.族2%（体积分数）加人P-强基乙服，充分混 匀.65℃求中加热1min~3min.此多中@设立因、阳性蛋叶对照.
8.32.2加人等体积的三氯甲烧/异戊醇（241.体积分数），轻轻振动，想底限会.13000r/nin真 5 min
