中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 1174-2003
猴D型逆转录病抗体检测方法
Antibody detection methods for simian retrovirus type D
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录人为瓶范性附录，本标准出国家认证认可应督管理委员会提出井扫口. 本标准由中华人民共和国公商出人规检验检疫局负责起年.本标准主要起草人，页建军、周税号、徐自忠、应驾松. 本标准系首改发布的检验检疫行业标准，
猴D型逆转录病抗体检测方法
1商图
2性引用文件
下列文件中的条款通过本标库的引用配或为本标维的条款，凡是性日期的引用文件，其能后是否可使用这些文件的量新版本，凡是不注目期的引用文件，其最新版本近用于本标准，
3维略语
下列路略语适用于本标准，
3.1 340维组物病变作用
3.2TCIDu 半数组织培养感染量.
3.3ELISA 购联免交发附试验，
3. 4 Westerm blot蛋白印迹试验，
3.5SDS-PAGE SDS家丙好斯肤胶电8，
4.
4 1 KLISA 原理
EL1SA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗棒分子共快墙合，武种晒合不会改变抗体的免疫学特性，电不影响酮的生物学活性，此种算标记批体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特是结 合，加底物溶液后，底物可在腾作增下使其所含的供案体由元色的还原型变成有色的氧化型，出现额色反应，因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相皮的免疫反应，颜色反皮的探线与标本中相应抗体 成扰原的量型正比，此种显也反应可通过ELISA检据仅进行定量图定，这科就务酶化学反应的单感性和扰原抗体反应的特异性结合起来，使ELIS人方接成为一种藏特算文敏感的检据方法.
4.2 Westem Biot
特异性抗体或美纯的抗原作为探针检测已四定好的抗原蛋自或抗体蛋白，这个探针用特定的放射或骗 先将被验的抗息或抗体蛋白些电冰分高并转移至一种器相支体上，阳航备好的针对抗原重白的最色系统进行标记，通过抗源抗体成应并有显色反应案判断被检物是否的特异的抗体减抗医物质，
5发拆和有料
5.1水：本标准所用水应各合GB/T6682-1992中二级水的规格.5.2病毒狼艾滋费D型进转录病毒（innretrorirustypeD，SRV），由指定单位提供， 5.3血情：猴艾滋府D整逆转录病毒阳性血清、阴性血清业指定单位美供.5.5单.Raj由他定单位供，200 μg/ml 5.7维持波和秘发：维持液为1540培费基中加人2%的胎牛血清（经56℃30min灭插）含青等素 200TU/mL得素200μg/ml.释液为维持液不加2%的胎牛血素，5.8羊抗脱1gG-SPA腾（规根过氧化物酶）、包批班（pH9.6）、封间液、共止液、底物液、血增神释缓冲
5.4被检.
孩等.按限录A配.
6器械和设备
6. 10单头和多头量量移签器及算头(20pL~209z)
6.1例置光学照锁，6.2普通光学显质镜， 6.3二氧化碳培养错，6.4冰箱（一20℃保存点键，-70℃保存毒）. 6.540孔成96孔家苯乙赠.6.6期标仪，6.9确脏开睡家票NC膜）、分析用建联、寿端.
6.7电源视和直电泳模.
7ELISA
7.1提作方涨
15min，次提细胞磷片，上清玻装于通析载，用聚乙二醇（PEG分子量20000）鼠水增五售，用20%~60%兼糖榜度离心挑化抗瓶（2.0mg/mL）.的释成1200或更高.
7.1.2批原滴定：将维缩的批源用H9.6的包被液按不到释度能释包被板，控7.2试验程序排作，2.1~2.5的抗原量高确释度，作为抗原的滴度，每批抗原流定一次. 每得释度加120的阳性血清和买性业，进行试验.在414mm波长处测定OD值，以是茶P/N值为
7.1.3比票1gG端报过氧化物脂结合物的滴定：在包被有批原的板上演加120的用性血建积阴性血 清各一始，热后加不间稀释的等结合售，以最高的释度的属结合物显示P/N省为2.1一2.5者为继合物的滴度，
7.2试验程序
7.2.1用pH9.6的包教解聊批原.加在骗标板上，每孔50p.4C过夜.
7.2.2试验时，取出板，将孔内防源塞液用排-用PBST洗三次，甩干.备用，
7.2.3用能师级冲将待检盘清作1100第释，每孔50L.每份血济加两孔，同时每狭板加1100的阳性血清或别性业清各润孔作对别，置逐盒中.37C1h.
7.2.4用PBST铁析三次，每孔加50μ1-用PBST作1 1500臀释的脂结仓物，置覆盒中，37C1h 7.2.5用柠瀘酸级冲硬将底物母液ABTS作1100据释，每孔加100μL.37℃10min~30min特阳 性血等充分显色后每孔加100pL 2mol/L 载服降止皮皮，
7.3随果列定
类414mm披长处岗定0D值，阳性、领性和背摄血消计英出2孔的平均道.
判定标准待测业情的OD银（P)与时性龙清的OD值（N)之比（P/N值）小于2.1为持强盘
8WesternBe绿作E序
8.1SDS藏胶电泳
8.1.1准备电珠的碳璃变层、根据生产厂家的认研变装攻璃额，井改在水平位置.
8.1.2尽快风电球破端夹是网覆人至离板于下1.5cm处，性意资均匀，胶成一直战，胶表面有气施，立即用增有一思龙管性射等把气拖星出，然后轻轻加入少量dHO于家表面，要均勾，保持胶表面成一 直线-胶像好后，量于室湿22C~25℃至少45min以上.
8.1.3指上层胶（排唱胶）前把下层胶表面水吸出，再加人4HO號一次.
8.1.4准备上层欧（账辖胶）.配制见期录A，配好后立即加在下层胶（分离股）上面，赞慢加人避免有气天使用，
8.1.5等上层胶（格增胶）碳图后，取出杭子用无高子水种扶加样植孔，将减控放人电冰精上.上下棚 均加人电林缓冲核，栓查是否理漏，能两发票板问服胶底部的气池，并用电源缓冲推冲统院孔.
8.1.6准备即样，第一.二行为低标准分子量和高标准分于量置白（可额先准备分嵌冻存各用）.其他各 行融据试验需要准备：
8.1.7对各批原测定强白推度，计算好样品量，标明.按量致人一小试管内，加人等量的2×标本级冲 液、充分用吸管激匀，便病资疆碎，轻轻盘上胶塞，放人佛水内建佛90s.加人澳盼蓝度5p1.~10p1
8.1.8披激计算量用型管轻物加人加神礼内，米使用时孔要用电脉缓冲液填病.
8.1.9电院.开始时电压为8V/cm疑胶，特染料进人分高胶码，将电压增加到15V/em截度，唯续电直财染料面达分高波鹿都，天闭电都，取下程胶，
8.2蛋白转移和抗单抗体试量
8.2.1自转等
膜在转移缓冲液中提施3min~5min.
8.2.1.2特整料支架平放在含有转参缓种雅的托盘中，在型料支架上孩一校绝，
8.2.1.3把经电泳完毕的破囊夹层取下，放于内有签子纸的盘内，轻轻起面层玻填（如胶粘着上层填下不案，则用吸管蛋暗疫把款冲下）.量腔长，并作记录，
8.2.1.4将三块湿纸对齐放在海绵上，依次放置纤排累膜、凝胶，另外三块纸及海强，在放置每一层时.均要去除它们之间的气账，若有气旅残器，则影喻转移敏果，最后用整料支架类紧上述各题，放入 电转研模内-注意纤能素胰一据基正程.胶-例著负税强酒电路电压40V 电至0 37A~0.2A 转移1. 5 b~$ h
8.2.15转移结来后，取出型科支架，依次去摊各星，用铅笔在胰的上缘作好标记，初下其中一个孔对应膜的二分之一，用氨基染色30x，10%乙酸脱色，检查转移是否究全：也可将转够后的凝胶作考
