中华人民共和国国家标准
GB/T 36775-2018
Detection and identification of Pseudocercospora angolensis Crous &U.Braun
中国国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局.本标准主要起草人：冯黎霞、胡学难、左然玲、武目涛、王卫芳、赵立荣、于璇.
柑橘斑点病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了植物检疫中相橘斑点病菌的检疫鉴定方法.本标准适用于柑橘属苗木和果实上相橘斑点病菌的检疫鉴定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
SN/T1538.1培养基制备指南第1部分：实验室培养基制备质量保证通则
3方法原理
柑橘斑点病菌分类、分布及寄主信息参见附录A.本标准以该病原菌寄主危害症状、形态学特征、培养特性作为主要检疫鉴定依据，致病性测定作为柑橘斑点病菌的辅助检疫鉴定依据.
4设备用具
4.1仪器设备
体视显微镜、生物显微镜、超净工作台、高压灭菌器、电子天平（感量0.01g）、生物培养箱.
4.2实验用具
标签、定性滤纸、样品袋、保鲜袋、手持放大镜、锻子、剪刀、解刀、酒精灯、载玻片、盖玻片、接种针、培养Ⅲ、烧杯、量筒、三角瓶、玻棒、微量移液器（可调试范围2.5μL~1000μL）、pH计.
5试剂和培养基
5.1试剂
无水乙醇、0.5%次氯酸钠（NaOC1）溶液、碳酸钙（CaCO）、无菌双蒸水.
5.2培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：称取200g马铃薯，15g葡萄糖，15g琼脂.马铃薯去皮切成小块后加水煮沸20min~30min，钞布过滤后加入15g琼脂，溶化后加入15g葡萄糖，去离子水补足1000mL，将培养基的pH值调至5.6，121C灭菌20min.也可采用商品化PDA粉按使用说明进行配制.
V8培养基（V8A）：100mLV8蔬菜汁，碳酸钙0.2g，琼脂粉150g，去离子水补足1000mL，121℃C
GB/T 36775-2018
灭菌20min
配制培养基时，遵循SN/T1538.1的要求.
6检疫鉴定方法
6.1现场查验
仔细检查植株或果实是否有附录A中表述的危害症状，采集的有疑似症状样品保存无菌透明塑料袋中，粘贴标签后冷藏保存，以备进一步分离.
6.2实验室鉴定
6.2.1直接镜检
如病枝或病果表面有明显病征，可直接在体式显微镜下观察记录病斑的细微特征，包括病斑的形态、大小和颜色，挑取病部分生孢子梗、分生孢子制成玻片，置于生物显微镜下镜检，观察记录分生孢子梗、分生孢子的额色和形态特征.
6.2.2保湿培养
如病叶、病果和病枝上只有可疑病状而无明显病征，则将病叶、病果或病枝（截成5cm）置于样品袋中，25C保湿培养，观察症状变化.
6.2.3分离培养
直接挑取病部的分生孢子梗或分生孢子团，置于PDA平板上；或采用组织分离培养法，用解剖刀将病健交界组织切成4mm×4mm进行表面消毒，0.5%NaOCl溶液浸泡5min，无菌水冲洗3次，最后用无菌滤纸吸干表面水分，放置于PDA平板上.每个PDA平板放置4块～6块样品组织，24C~28C条件下保湿培养.培养5d～7d.用无菌接种针从菌落边缘挑取菌丝块置于V8培养基上进行纯 化培养30d，培养条件为12h光亮，12h黑暗.定期观察记录菌落的形态、额色、大小和质地、分生孢子颜色和形态特征，疑似菌株转到PDA培养基上纯化3次，保存备用.
6.2.4致病性测定
将纯分离物作为供试菌株用伤口接种法接种幼嫩新鲜相橘果实（果龄1周～3周为佳）.首先供试菌株在PDA平板上于25C条件下12h光亮、12h黑暗培养30d，然后挑取菌落上的分生孢子，用无菌 水制成孢子悬浮液（孢子浓度为3.0×10/mL）.用70%乙醇对供试柑橘果实表面消毒.用无菌刀片在果身切出1cm~2cm宽度的圆环，去掉果皮，将2mL孢子悬浮液注入伤口内，无菌水做对照，将无菌湿润的滤纸盖在伤口处保湿，放人样品袋中，置于25℃下保湿培养.每个菌株接种柑橘不少于10个.定期观察接种果实的发病情况，发病后按照6.2.3方法分离病菌，对病菌形态鉴定.
7鉴定特征
7.1症状
叶片上具黄绿色病斑，叶斑病菌两面生病斑直径4mm~10mm左右，幼嫩叶片病斑常表现黄萎
坏死，严重时，叶片脱落：果实病斑圆形至不规则形，离散或联合，最大直径可达3cm~4cm，嫩果症状 常从增生产生瘤状病斑开始，边缘有黄色晕圈，成熟果实的病斑一般是平坦的，病部木栓化（症状图参见附录 B 图 B.1).
7.2菌落特征
在V8培养基平板上24℃～28℃培养30d后，菌落平铺，星灰白色，气生菌丝旺盛，绒毛状.培养后期，从菌落中央开始变成灰橄榄色，黑灰色至黑色，逐渐菌落边缘菌丝体颜色也逐渐加深，菌落中央隆起，质地逐渐变硬，炭质，表面凹凸不平，菌落背面为深墨绿色.
7.3病菌形态
分生孢子梗从气孔生出，浅褐色至褐色，具多个隔膜，平滑，宽3μm~7pm，高27μm~240μm分生孢子梗单生、丛生或形成分散的宽的联丝体，无分枝，直径为12μm～5μm，通常从子座上长出，子座直径为30um~60um，分生孢子顶生或顶侧生，单生或2个~4个多孢链状生，平滑，透明至浅褐色，圆柱形或稍弯，顶部圆形，基部稍平钝至弧形弯曲，1个~6个（通常3个～4个）分隔，23μm~87 pm长，分生孢子4μm~5μm（4μm~6.5μm）宽，基部2pm~3 μm宽.产孢细胞末编具轻微膝状弯曲，产孢位置具明显的孢痕疤，但不增厚（病菌形态特征图参见附录C图C.1）.
7.4致病性测定
分离得到的病菌分离物得到柯赫氏法则验证.即以柑橘果实为接种材料，利用6.2.4方法接种30d后，柑橘果实出现干腐、组织硬化等症状.从病部得到的分离物培养特征、形态特征与供试接种菌株一致.
8结果判定
符合下列任一种情况均可判定为检出柑橘斑点病菌：
如果病部有明显的病状和病征，进行分离培养后，病菌形态学特征和菌落特征与7.1和7.2吻合.
如果病部有病状但无病征，经保湿培养和（或）分离培养所产生的病菌形态学特征和菌落特征与7.1、7.2吻合，致病性测定结果符合7.4.
9样品和资料的保存
9.1样品的保存
检验为阳性的样品标注来源、寄主、分离时间、鉴定人后置于4C冰箱保存：病菌纯培养菌株在含20%甘油的冻存管中一80C保存，或将菌株转接在PDA斜面上培养，待菌丝体长满斜面后，置于4℃下保存，并定期（约180d）转管.
对鉴定为柑橘斑点病菌的样品至少保存6个月，以备复核谈判和仲裁，样品保存期满后，需无害化处理.
