GB/T 14926.21-2008
前言
GB/T14926《实验动物》共54个部分，为不同微生物和病毒检测技术方法。
本部分自实施之日起代替GB/T14926.21-2001《实验动物兔出血症病毒检测方法》。
本部分与GB/T14926.21-2001相比主要技术差异如下： a）增加兔出血症病毒核酸（RHDV）核酸检测方法； b）确定免免疫接种RHDV疫苗后的血清抗体合格判定标准。
本部分由全国实验动物标准化委员会提出并归口。
本部分起草单位：全国实验动物标准化技术委员会。
本部分主要起草人：贺争鸣、付瑞、田克恭。
本部分所代替标准的历次版本发布情况为： GB/T 14926. 211994,GB/T 14926. 21-2001。
GB/T 14926.21-2008
实验动物免出血症病毒检测方法
1范围 GB/T14926的本部分规定了兔出血症病毒（RHDV）的检测方法。
本部分适用于兔RHDV抗原、抗体和病毒核酸的检测。
2规范性引用文件 下列文件中的条款通过GB/T14926的本部分的引用而成为本部分的条款。
凡是注日期的引用文 件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本 部分， GB/T14926.53实验动物血凝试验 GB/T14926.54实验动物血凝抑制试验 3原理 血凝试验（HA）：在一定条件下，RHDV能凝集人“O”型红细胞，产生可见的凝集反应。
根据这一 特性检测兔肝组织中有无RHDV抗原。
血凝抑制试验（HAI）：在一定条件下，RHDV凝集人"O"型红细胞的能力可被特异性抗体所抑制。
根据这一特性检测免血清中有无RHDV抗体。
核酸检测：根据RHDVVP60基因序列保守的特点，设计特异引物，扩增目的片段，检测兔组织中 的 RHDV 核酸。
4主要试剂与器材 4.1试剂 4.1.1血凝素 人工感染或自然发病的兔肝组织，经研磨制成10%悬液，3000r/min离心10min而获得的上 清液。
4.1.2阳性血清 RHDV抗原免疫或RHDV自然感染恢复后的兔血清。
4.1.3阴性血清 无RHDV感染、未经免疫的兔血清。
4.1.4人"0"型红细胞. 4.1.5缓冲液与溶液 4. 1. 5. 1PBS(pH7. 4) NaC18g KC10.2 g NaHPO, 12HO2.83 g KH;PO,0.2 g 去离子水1 000 mL 4. 1. 5. 2TRIzol Reagent,
GB/T 14926.21-2008 4. 1. 5. 3 50 × TAE Buffer(pH8. 5) Tris242 g 醋酸57.1 mL Na;EDTA • 2HO37.2 g 去离子水1 000 mL 4.1.5.4澳乙锭（10 mg/ml). 4. 1. 5.5 6×Loding Buffer。
4.1.5.6氨苄青霉素（100mg/mL). 4.1.5.7三氯甲烷（分析纯）. 4.1.5.8乙醇（分析纯）. 4.1.5.9异丙醇（分析纯）。
4.1.6酶与缓冲液 4. 1. 6. 15 × AMV RT Buffer AMV RTase(10 U/μL). 4. 1. 6. 2 RNase inhibitor(40 U/μL) 。
4.1.6.3 DEPC-HO 4. 1. 6. 4随机弓1物 9mers(500 μg/mL)。
4. 1. 6. 5 dNTP mixture(2. 5 mmol/ L each), 4. 1. 6. 6 MgCl, (25 mmol/L) ,10× PCR Buffer,Taq DNA polymerase(5 U/yL) , 4.1.7培养基 4.1.7.1LB培养基 tryptone10 g yeast extract5g NaCI10 g 去离子水1 000 mL 4.1.7.2 LB/Amp tryptone10 g yeast extract5g NaC110 g
100 μg/mL 去离子水1 000 mL 4.1.8琼脂糖凝胶Agarose L03. 4.1.9感受态细胞与载体 4.1.9.1适用于所构建克隆载体的大肠杆菌感受态细胞。
4.1.9.2DNA片段琼脂糖凝胶纯化试剂盒。
4.1.9.3可用于连接PCR产物的商品化T载体。
4.1.9.4质粒小量提取试剂盒。
4.2器材 4.2.1微量振荡器。
4.2.2微量血凝反应板（U型或V型）。
4.2.3微量加样器(容量 0.5pL~10μL,10μL~100xL,20xL~200pL，100pL~1 000xL)。
4.2.4生物安全柜。
4.2.5冷冻离心机 4.2.6紫外分光光度仪。
2
GB/T 14926.21-2008 4.2.7PCR仪. 4.2.8电泳仪。
4.2.9紫外透射仪。
4.2.10恒温培养箱。
4.2.11恒温摇床。
4.2.12恒温水浴箱。
4.2.13超纯水系统. 4.2.14冰箱。
5操作步骤 5.1采用HA方法（见GB/T14926.53）进行病毒抗原检测。
5.2采用HA1方法（见GB/T14926.54）进行病毒抗体检测。
5.3病毒核酸检测 5.3.1引物设计 根据RHDV FDR株序列（GenBank登录号：NC_001543），针对VP60基因区段设计引物。
引物在 RHDV基因组中的位置、核苷酸组成及预期扩增目的基因长度见表1。
表1RT-PCR引物 引物位置序列产物大小 正向引物P1nt 6254- nt 62715′-ATGCCAATGCTGGGTCTG-3′368bp 反向引物 P2nt 6621- nt 66025'-TTGAGGCGTGTATGTGATGG-3' 5.3.2RNA提取 5.3.2.1在生物安全柜内，取RHDV感染的兔肝组织50mg~100mg，置于灭菌玻璃研磨器中，加 1mL灭菌PBS（pH7.4）充分研磨。
5.3.2.2将肝组织匀浆转移至1.5mL洁净离心管中，加入1mlTRlzolReagent，混匀.室温放置 10 min. 5.3.2.3加0.2mL三氯甲烷，充分混匀10s,室温放置10min.4C12000r/min离心15min 5.3.2.4取上清，加等体积异丙醇，室温20min，4C12 000r/min离心15min. 5.3.2.5弃上清，沉淀以1mL75%乙醇（现用现配）洗涤后，室温干燥至RNA呈透明膜状。
5.3.2.6加40LDEPC-HO溶解RNA（沉淀），紫外分光光度仪测定所提取的RNA，立即进行反转 录（RT）或-70C保存。
警告：DEPC对眼睛和气道粘膜有强刺激，在操作中应在通风条件下进行，使用时戴口罩，不小心沾 到手上应立即冲洗。
5.3.3反转录（RT） 5.3.3.1RT反应体系为25L，依次加人如下成分：5yL5×AMV RT Buffer，5pL dNTP mixture (2. 5 mmol/ L each) ,1 μL 机引物)(500 μg/mL),0. 5 μL RNase inhibitor(40 U/μL) 12. 5 μL RNA 模版1 μL AMV RTase(10 U/μL), 5.3.3.2反转录反应条件为：37C90min，95C5min，所得cDNA可用作PCR反应模板。
5.3.3.3每次进行RT时均设标准阳性、阴性及空白对照。
5.3.4 RT-PCR 2 L dNTP mixture,1 μL 正向引物 P1(50 pmol/L), 1 μL 反向引物 P2(50 pmol/L)，2 yLcDNA, 0. 5 μL Tαq DNA polymerase(5 U/μL) ,36. 5 μL ddH; O....
