中华人民共和国国家标准
GB/T 15670.3-2017
农药登记毒理学试验方法 第3部分：急性经口毒性试验 序贯法
Toxicological test methods for pesticides registrationPart 3:Acute oral toxicity test-Up-and-down-procedure
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：第1部分：总则；第2部分：急性经口毒性试验霍恩氏法；第4部分：急性经口毒性试验概率单位法； 第3部分：急性经口毒性试验序贯法：第5部分：急性经皮毒性试验；一第6部分：急性吸人毒性试验：第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验： -第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验：第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验：第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验：第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验：第12部分：短期重复吸人染毒（28天）毒性试验； 第13部分：亚慢性毒性试验；第14部分：细菌回复突变试验；第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验；第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验； 第18部分：嘀齿类动物显性致死试验；第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验；第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验；一第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验；-第23部分：致畸试验：第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第26部分：慢性毒性试验； 第27部分：致癌试验；第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；第29部分：代谢和毒物动力学试验.本部分为GB/T15670的第3部分.本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草. 本部分由中华人民共和国农业部提出并归口.本部分起草单位：农业部农药检定所.本部分主要起草人：贺锡雯、张丽英、曲蔓聋、陶传江.
农药登记毒理学试验方法 第3部分：急性经口毒性试验序贯法
1范围
GB/T15670的本部分规定了急性经口毒性试验序贯法的基本原则、方法和要求. 本部分适用于为农药登记而进行的急性经口毒性试验.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB14925实验动物环境及设施
农药登记资料规定（中华人民共和国农业部令[2007]第10号）
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
急性经口毒性acute oral toxicity
一次或在24h内多次经口给予实验动物受试物后，动物在短期内出现的健康损害效应.
所给受试物的量，以实验动物单位体重所接受受试物的质量表示（mg/kg体重）.
半数致死剂量medianlethal dose
LD;
以实验动物单位体重接受受试物的质量表示（mg/kg体重）.
3.4
剂量与特定效应的发生率间的关系.
4试验目的
和剂量-反应关系，为急性毒性分级、标签管理和其他毒理学试验剂量选择提供依据. 急性经口毒性试验是评估受试物毒性的第一步.通过短时间经口染毒初步了解受试物的毒性特征
5试验概述
序贯法（uprand-down-procedure，UDP)是一个阶梯式的染毒程序.使用单一性别的动物，一次染
毒一只.第一只动物的染毒剂量最好低于LD的估计值.后续动物染毒剂量的增减，取决于前一只动物的染毒结果（存活或死亡）：在不能获得受试物LD的初步估计值及剂量-反应曲线斜率资料时，计算机摸拟结果提示起始剂量可选择175mg/kg体重，采用0.5的反对数（对应于一个默认的剂量级数因子3.2）计算剂量间距.以最大似然法计算LD的点估计值和95%可信区间.
注：剂量级数因子由剂量-反应曲线斜率的倒数的反对数决定（3.2是斜率为2时的级数因子）.
正式试验使用的动物数大约6只～9只.限量试验不超过5只.本方法仅适用于动物染毒后1d~2d内死亡的受试物，对预期染毒后死亡延迟至5d以上（含5d）的受试物不适用.
6试验方法
6.1受试物
受试物可配制成水溶液、油溶液或悬浮液.尽可能选用水或食用油（如玉米油）作溶剂，其他如羧甲基纤维素钠、明胶和淀粉可将受试物配制成混悬液或糊剂.除水以外的溶剂，用前应了解其毒理学特性，必要时设立溶剂对照组.染毒时，不同浓度受试物现用现配.一次染毒容量不超过1mL/100g体重，水溶液可达到2mL/100g体重，通过调整受试物溶液的浓度，使各剂量组经口染毒的容量一致，如 一次染毒容量太大，可在24h内分2次~3次给予.
6.2实验动物
6.2.1种属和性别
晒齿类动物中可选用SD大鼠或Wistar大鼠.单一性别，通常采用雌性动物（应为未妊娠和未经产的），比较敏感.如有相关结构的化学物的毒理学、代谢和毒物动力学研究证明雄性大鼠更敏感，可选择后者.
6.2.2年龄和体重
健康成年大鼠鼠龄在8周～10周内.动物体重变异不超过动物平均体重的土20%.按随机原则逐只进人试验.
6.3饲养环境和条件
动物饲养环境和条件应符合GB14925的有关规定，喂饲常规动物饲料，饮水量不限.试验前，人选动物在饲养环境中至少检疫、适应3d
采9
6.4.1限量试验
6.4.1.1受试物的一次染毒剂量为5000mg/kg体重.先给一只动物染毒，在染毒48h内动物存活，再给2只动物相同的剂量，观察14d，如动物依然存活可终止试验或在给相同剂量的2只动物中，1只存活1只死亡，再追加2只动物，染毒的5只动物有大于或等于3只动物存活，可结束试验，表明该受试物的 LD; >5 000 mg/kg 体重.
6.4.1.2上述5只染毒动物中有3只动物分别在48h内死亡或死亡时间延迟在14d观察期内，终止染毒，进人正式试验.
6.4.2正式试验
6.4.2.1试验前，大鼠禁食过夜，饮水不限.
6.4.2.2起始剂量和剂量级数因子的选择.在无法得到受试物致死剂量的估计值时，默认的起始剂量为175mg/kg体重.对应于剂量-反应斜率为2的级数因子3.2所设定的剂量序列为：1.75mg/kg体重 5.5 mg/kg 体重 17.5 mg/kg 体重 55 mg/kg 体重 175 mg/kg 体重 555 mg/kg 体重和 2 0 mg/kg体重或 1.75 mg/kg 体重5 5mg/kg体重.17.5 mg/kg 体重，55 mg/kg 体重，175 mg/kg体重，555 mg/kg体重，1750mg/kg体重和5000mg/kg体重.如已知受试物的剂量-反应曲线斜率比较陡或较平坦， 剂量级数因子可以缩小或加大，附录A列出了起始剂量为175mg/kg体重，斜率在1~8的剂量级数可供选择.
6.4.2.3试验开始，称量禁食后动物的体重，使用滥胃针头经口染毒，一次一只动物，每只动物的染毒间隔时间为48h，第二只动物染毒剂量取决于第一只动物的染毒结果，如动物死亡或呈濒死状态，剂量追加4只动物序贯染毒后结束试验，或当达到任一终止试验的规定（见6.4.2.6）时，可结束试验.染毒后大鼠应继续禁食3h~4h.对每只动物的观察期为14d.
6.4.2.4如染毒48h内动物存活，面在后续观察期内出现延迟死亡，表明剂量选择不合适，可考虑再给2只动物低于引起死亡的剂量，重新开始试验，延长观察期.
6.4.2.5试验结果以最大似然法（见附录B）计算该受试物的LD和95%可信区间.
6.4.2.6符合下述任一条件即可结束试验：a）在上限剂量范围的序贯染毒中有3只动物存活时；b）在任取的6只序贯染毒动物中出现5次相反结果时；c）在第一次出现相反结果后至少有4只动物序贯染毒，从第一次相反结果后，开始计算每一个剂 量的似然值，其给定的似然比超过临界值.
LD和斜率的变异大，在出现相反结果后有4只～6只动物序贯染毒即符合终止试验的规定.在有些情况下，受试物的剂量-反应曲线斜率平坦，可能需要追加动物达到15只.
6.5试验观察和检查
6.5.1临床观察
在染毒后24h（特别在染毒后30min内和第一个4h）以及14d的观察期内，每天定时观察并详细记录每只动物的中毒反应.临床观察至少包括：
a）中枢神经系统和神经肌肉系统：体位异常、叫声异常、不安、呆滞、震额、抽搐、麻痹、运动失调、b）植物神经系统：瞳孔扩大或缩小、流涎和流泪； 对外反应过敏或迟钝，异常行为如过度反复抓挠口周、梳理、转圈，甚至自残、倒退行走等；c）呼吸系统：鼻孔流液、员纽、员翼扇动、呼吸深缓、呼吸过速、蜂腰；d）泌尿生殖系统：会阴部污移、有分泌物、阴道或乳房肿胀；e）皮肤和被毛：皮肤充血、紫细、被毛蓬松或潮湿、污移；f）眼：眼球突出、结膜充血、溢血性分泌物、角膜浑浊； g）消化系统：腹泻、厌食.
记录出现震、抽搐、流诞、腹泻、嗜睡和昏迷的时间、严重程度，死亡时间或恢复时间，濒临死亡和剧烈痛苦的动物以及试验结束尚存活的动物，最终应给予人道处死.
6.5.2体重称量
应分别在染毒前、染毒后（至少每周一次）和处死前称量并记录动物体重.
6.5.3病理学检查
在试验期内中毒死亡的和人道处死的动物应做大体解剖，记录每只动物的大体病理改变，染毒后
