中华人民共和国国家标准
GB/T 15670.21-2017
农药登记毒理学试验方法 第21部分：体内哺乳动物肝细胞 程序外DNA合成（UDS）试验
Toxicological test methods for pesticides registrationPart 21: Unscheduled DNA synthesis (UDS) test with mammalian liver cells in vivo
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分：第1部分：总则；第2部分：急性经口毒性试验霍恩氏法；第3部分：急性经口毒性试验序贯法： 第4部分：急性经口毒性试验概率单位法；第5部分：急性经皮毒性试验；第6部分：急性吸人毒性试验：第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验： -第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验；第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验：第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验：第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验：第12部分：短期重复吸人染毒（28天）毒性试验； "第13部分：亚慢性毒性试验；第14部分：细菌回复突变试验；第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验；第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验；一第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验； 第18部分：嘀齿类动物显性致死试验；第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验；第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验；第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS）试验； 一第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验；-第23部分：致畸试验：第24部分：两代繁殖毒性试验；第25部分：急性迟发性神经毒性试验；第26部分：慢性毒性试验； 第27部分：致癌试验；第28部分：慢性毒性与致癌合并试验；第29部分：代谢和毒物动力学试验.本部分为GB/T15670的第21部分.本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草. 本部分由中华人民共和国农业部提出并归口.本部分起草单位：农业部农药检定所，本部分主要起草人：张宏伟、张丽英、陶传江.
第21部分：体内哺乳动物肝细胞 农药登记毒理学试验方法 程序外DNA合成（UDS）试验
1范围
GB/T15670的本部分规定了体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成试验的基本原则、方法和要求.
本部分适用于为农药登记面进行的体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成试验.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB14925实验动物环境及设施
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件，
程序外DNA合成unscheduled DNA synthesis；UDS
发生在细胞周期的S期半保留DNA程序合成之外的DNA合成.
正修复的细胞cell in repair
净核银粒高于本实验室历史性阴性对照值的细胞.
净核银粒net nuclear grain；NNG
在放射自显影UDS试验中细胞内UDS活性的定量测定，计算为核银粒数（NG）减去等于核面积的细胞质内银粒平均数（CG），即NNG=NG-CG.由各细胞计算NNG数，再将一个培养物或平行培养 物中的细胞 NNG汇总.
4试验目的
体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS）试验用于检测受试物对动物肝细胞诱发DNA修复的影响.
5试验概述
体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS）试验是利用哺乳动物进行的体内体细胞遗传毒理学
试验，遗传学终点为原发性DNA损伤.
UDS反应的测定取决于DNA损伤部位切除和取代的碱基数.本试验适用于检测“长程修复”（20对~30对碱基），对“短程修复”（1对~3对碱基）的敏感性差.而且，由于DNA损伤未修复、错配修复或错复制均可引起致突变事件，UDS反应并不完全真实反映DNA修复过程.由于本试验检测整个基因组，敏感性较高，对本试验提供致突变活性的信息缺乏特异性可能有所补偿.
将新分离哺乳动物肝细胞，移人含有胸腺嘧啶核苷（H-TdR）的培养瓶中，孵育一定时间后，观察H-TdR掺人情况，如果受试物造成细胞DNA损伤，必然引起细胞的自主性DNA修复，在修复过程中H-TdR整合人DNA链中，造成H-TdR在修复中的掺人，再用放射自显影或液闪计数的方法来观察掺人H-TdR的量.掺人越多说明受试物对DNA的损伤越广泛.
6试验方法
6.1准备
6.1.1实验动物和饲养环境
一般选用健康初成年的大鼠，在试验开始时，动物体重变异应不超过同性别平均体重的土20%.选用常规何料，饮水不限制.如果受试物掺人何料进行染毒，应选择适当的饲料以保证受试物充分混合.动物可单独饲养或同性别分小组笼养，实验动物饲养条件应符合GB14925的有关规定.
6.1.2动物试验前准备
试验前动物要在实验动物房环境中至少适应5d时间.将动物随机分为受试物组和对照组.
6.1.3受试物准备
固体受试物应溶于或悬浮于适当的溶剂/赋形剂中，并于动物染毒前稀释.液体受试物可直接染毒，或在染毒前稀释.应新鲜制备受试物，除非稳定性资料证明可以贮存.
6.1.4溶剂/赋形剂
形剂，应有其相容性的资料，推荐首先考虑使用水性溶剂/赋形剂. 溶剂/赋形剂在所用剂量水平不应产生毒效应，不应与受试物反应.如使用未充分了解的溶剂/赋
6.1.5对照
每个试验都应包括同时进行的阳性对照和阴性（溶剂/赋形剂）对照.除了受试物染毒不同外，对照组动物应以与染毒组动物相同的方式进行操作.
阳性对照在暴露水平应预期得到超过本底值的UDS增加.阳性对照剂量应使效应很清楚，但并不使读片者立即发现其为阳性对照标本片，阳性对照的染毒途径可以不同于受试物染毒途径.常用的阳性对照物见表1.
表1阳性对照物
采样时间 化学物 CAS号N-二甲基亚硝胺早期采样(2 h~4 h) (N-nitrosodimethylamine NDMA) 62-75-9晚期采样（12 h~16 h) (.N -2-acetamidofluorene 2- AAF) 2-乙酰氨基荡 -96-S
6.2.1动物的数量和性别
应采用适当的动物数.每组至少有3只可供分析的动物.如已有充分的本底对照数据库，则同时进行的阴性对照组和阳性对照组仅需1只或2只动物.
如在进行本试验时，已有资料表明同一品系、相同的暴露途径，在不同性别之间毒性无差别，则用单一性别（优先用雄性）动物即可，当人暴露受试物可能有性别特异性时，可选择适当性别的动物进行试验.
6.2.2染毒程序
受试物通常采用一次染毒.
6.2.3剂量水平
剂量一般应为高剂量的50%～25%.在较低的无毒性剂量就有特殊生物活性的受试物（如激素和有丝 通常设2个剂量组.高剂量应产生毒性，如根据相同的染毒方案更高剂量可产生动物死亡，较低分裂原）的剂量设置标准要单独考虑，并应逐例评价.如无适当的资料，需进行确定剂量范围的试验，应在同一实验室利用同一品系、性别的动物和染毒方案.
高剂量也可规定为引起肝脏某些毒性（如核固缩）的剂量.
6.2.4限量试验
如果单次染毒剂量水平或同一天2次染毒达到2000mg/kg体重，不产生可观察到的毒性效应，并且根据结构相关化合物的资料预期受试物无遗传毒性，则不需要进行2个剂量水平的完整试验.如果人暴露的预期量过高，也可在限量试验中应用更高的剂量水平.
6.2.5染毒
2mL/100g体重，若利用更高体积，应说明理由.除了在较高浓度毒效应增强的刺激性或腐蚀性物质 受试物通常用灌胃染毒.如果合理，其他的染毒途径也可接受.一次胃的最大液体容积不超过外，应调整浓度使受试物容积减少，保证在的剂量水平为等容积.
6.2.6肝细胞制备
动物染毒后12h~16h制备肝细胞.如无明显的阳性反应，则进行早期采样（染毒后2h~4h）.但是，根据已有的毒物动力学资料也可利用其他采样时间.
以胶原酶原位灌注肝，分离肝细胞，贴壁后，进行哺乳动物肝细胞短期培养.阴性对照组动物的肝细胞存活率应大于50%.
6.2.7UDS测定
移去培养基后，细胞再培养在含过量未标记胸腺啶的培养液中，以除去未掺人的放射性：如培养时间较长可免去此操作.然后，细胞再经淋洗、固定、染色，计数银粒.每个动物制备2个～3个样本片.
