中华人民共和国国家标准
GB/T 20443-2006
鸡组织中己烯雌酚残留的测定 高效液相色谱-电化学检测器法
Method for the determination of diethylstilbestrol in chicken tissueHigh performance liquid chromatography with electrochemical detection
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布
前言
本标准的附录A为资料性附录.本标准由中华人民共和国农业部提出并归口. 本标准起草单位：农业部畜禽产品质量监督检验测试中心.本标准主要起草人：杨清峰、吴银良、薛毅、单吉浩、李卫东、王海、刘勇军.
高效液相色谱-电化学检测器法 鸡组织中已烯雌酚残留的测定
1范围
本标准规定了鸡组织中己烯雌酚残留量测定的高效液相色谱-电化学检测器方法.本标准适用于鸡组织中（鸡肌肉和鸡肝脏）己烯雌酚残留量的测定.
2原理
鸡组织中的己烯雌酚经叔丁基甲基醚提取、C柱净化，甲醇和水的混合液洗脱.以甲醇-磷酸盐缓冲液（pH3.5）为流动相，用高效液相色谱-电化学检测器法测定，外标法定量，电化学检测器对可氧化 还原的化合物具有很高的灵敏度，利用这一特点，可测出痕量的己烯雌酚.
3试剂和材料
试剂除注明外均为分析纯，实验用水为去离子水.
3.1叔丁基甲基醚：色谱纯. 3.2甲醇：色谱纯.3.3氢氧化钠溶液：1moL/L水溶液.3.4乙酸.3.5乙酸溶液：体积分数为20%水溶液.3.7己烯雌酚标准品：纯度≥99% 3.6磷酸盐缓冲液：0.05moL/L磷酸二氢钾水溶液，pH3.5.3.8己烯雌酚标准储备液：准确称取一定量的已烯雌酚标准品于棕色容量瓶中，用甲醇溶解后定容至刻度，得100μg/mL的标准储备液.储存于4C冰箱中，使用前恢复至室温.3.9己烯雌酚标准工作液：用前将储备液用甲醇稀释为50ng/mL~2000ng/mL的浓度系列.
4仪器和设备
4.1高效液相色谱仪，配电化学检测器.4.2均质器.4.4固相萃取小柱：C柱，容积为6ml. 4.3固相萃取装置.4.5旋转蒸发仪.4.6心形瓶：100mL.4.7分液漏斗：100mL. 4.8酸度计.4.9涡旋泥均器.4.10真空泵.4.11样品浓缩仪.
5样品处理
样品采集后于10000r/min下匀浆（或者将样品尽量粉碎），于一20C以下冷冻保存，分析用时将其
解冻后使用.
6分析步骤
6.1提取
称取试样10g（精确至0.01g）于50mL带盖离心管中，加人15mL叔丁基甲基醚，用均质器以10000r/min的速度均质15s后以3000r/min的速度离心10min，收集上清液，再用15mL叔丁基甲1 min，静置分层30min，收集水相并用体积分数为20%的乙酸调pH至4.5，备用. 基醚提取一次，合并有机相至100mL分液漏斗中，加人1moL/L的氢氧化钠溶液10mL，剧烈振摇
6.2净化
依次用5mL甲醇、5mL水和5mL的甲醇：水[V（甲醇）V（水）=4555]预洗C小柱，然后将6.1中备用液过柱，弃去流出液：再用4mL的甲醇：水[V（甲醇）V（水）=8020]洗脱，洗脱液用旋转蒸发仪浓缩至约1mL后用甲醇转移至2.0mL的小瓶中，用氮气吹干，最后用300gL流动相溶解供高 效液相色谱-电化学检测器测定用.
6.3测定
6.3.1高效液相色谱条件
色谱柱：C3.9mm×150mm
流动相：甲醇-0.05moL/1磷酸盐缓冲液（pH3.5）[V（甲醇）V（0.05mol/1.磷酸盐缓冲液）=6040];
流速：1.0mL/min:
电化学检测器的灵敏度设在1nA，工作电势为900mV；
进样量：40
6.3.2高效液相色谱测定
根据样液中已烯雌酚残留量情况，选定峰面积相近的标准工作溶液.标准工作溶液和样液中己烯雌酚响应值均应在仪器检测线性范围内.标准工作溶液和样液等体积参插进样进行测定.在上述色谱条件下，已烯雌酚保留时间约为7.2min，标准品色谱图参见附录A中图A.1.
6.3.3空白试验
除不加试样外，采用6.1~6.3.2的测定步骤进行平行操作.
6.3.4结果计算和表述
用色谱数据处理系统或按式（1）计算试样中己烯雌酚残留量：
式中：
X试样中己烯雌酚残留量，单位为微克每千克（μg/kg）： A-样液中己烯雌酚峰面积：A-标准工作液中己烯雌酚峰面积；--最终样液所相当的试样质量，单位为克（g）. V样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；
（-标准工作液中己烯雎酚的质量浓度，单位为微克每升（gg/L）：
7检测限、回收率
7.1检测限
本方法在鸡组织（鸡肉和鸡肝）中的检测限为1pg/kg.
7.2回收率
本方法在1pg/kg~100μg/kg添加浓度的回收率为60%~110%.
（资料性附录）标准品色谱图
己烯雌酚标准品的液相色谱图见图A.1.
图A.1 已烯雎酚标准品的液相色谱图
