中华人民共和国国家标准
GB/T 20751-2006
鳗鱼及制品中十五种喹诺酮类药物 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
Method for the determination of 15 quinolone residuesin eels and eel products-LC-MS-MSmethod
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布
前言
本标准的附录A和附录B为资料性附录.本标准由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出. 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口.本标准起草单位：中华人民共和国泰皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检疫局、食品安全分析与检测技术教育部重点实验室（福州大学）.本标准主要起草人：庞国芳、杨方、刘正才、余孔捷、卢声宇、李耀平、陈国南.
本标准系首次发布的国家标准.
鳗鱼及制品中十五种喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了鳗鱼及制品中十五种喹诺酮类药物残留量的液相色谐-申联质谱测定方法.本标准适用于般鱼及制品中十五种喹诺酮类药物的测定.本标准的方法检出限：十五种座诺酮类药物的检出限均为5pg/kg.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T 6379. 1-2004 ISO 5725-1;1994 IDT)
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，ISO5725-2：1994，IDT）
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T 6682-1992，neqISO 3696：1987)
3原理
试样中残留的喹诺酮类药物采用乙晴提取，提取液经正已烷液液分配脱脂后，以强阳离子固相萃取小柱净化，液相色谱-串联质谱法测定，外标法定量.
4试剂和材料
除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1乙晴：色谱纯.4.2甲醇：色谱纯.4.3正已烷. 4.4浓氨水.4.5甲酸.4.6乙酸铵.4.7无水硫酸钠：650C灼烧4h.冷却后储于密封容器中备用，4.8氨水甲醇：2575.量取25mL氨水（4.4），以甲醇（4.2）定容100mL，混匀. 4.9甲酸溶液：0.1%.移取1mL甲酸（4.5），以水定容1L.4.10乙酸铵缓冲液：10mmol/L.称取0.77g乙酸铵（4.6）.溶于约700mL水中，以甲酸调节pH=4.6，以水定容11.4.11十五种唑诺酮类药物标准物质：氟罗沙星、氧氟沙星、依诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、4.12标准储备溶液：100mg/L.准确称取十五种唑诺酮类药物标准物质（4.11）各10.0mg，分别用 洛美沙星、单诺沙星、奥比沙星、双氟沙星、沙拉沙星、司帕沙星、恶喹酸、萘啶酸、氯甲喹，纯度均≥98%.甲醇溶解并定容至100mL，该标准储备液置于4C冰箱中可保存一个月.
GB/T 20751-2006
4.13标准工作溶液：根据需要取适量标准储备液（4.12），以甲酸溶液（4.9）乙晴（4.1）（91）稀释成适当浓度的混合标准工作溶液，标准工作溶液要现配现用.4.14强阳离子交换柱（SCXSPE柱）或相当者：500mg，3mL.用前依次以3mL甲醇、3mL水、3mL 10mmol/L乙酸铵缓冲液（4.10）活化，保持柱体湿润.4.150.22 yum滤膜.
5仪器
5.1液相色谱-串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源.5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g.5.3组织接碎机.5.4旋涡振荡器. 5.5分散器：转速应达到10000r/min.5.6超声波发生器.5.7氮气浓缩仪.5.9真空泵：真空度应达到80kPa. 5.8固相萃取装置.5. 10微量注射器：1 mL~5mL，100L~1 000yuL.5.11离心机：转速应达到4 000r/min.
6试样的制备与保存
6.1试样制备
般鱼去头，将皮、肉分离后先取鱼皮置于微波炉中，以中高功率加热30s后取出切成小块，将鱼肉切成小块，将二者一并放入组织捣碎机均质，充分混匀，装人清洁容器内，并标明标记，
鳗鱼制品取可食部分切成小块，放入组织搞碎机均质，充分混匀，装人清洁容器内，并标明标记. 制样操作过程中应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化.
6.2试样保存
试样于-18C以下保存，新鲜或冷冻的组织样品可在2C~6C贮存72h.
7测定步骤
7.1提取
称取5g试样（精确至0.01g）置于50mL聚丙烯离心管中，加人约5g无水硫酸钠（4.7），25mL50mL比色管中，另取一50ml离心管加人15mL乙晴，洗涤分散刀头10s，洗涤液移人第一支离心管 乙晴，使用分散器（5.5），在10 000r/min分散提取30 s 4000r/min离心（5.11)5min，上清液转移至中，用玻棒搅动残渣，旋涡振荡（5.4）提取1min，超声波振荡（5.6）提取5min 4000r/min离心5min，上清液合并至50mL比色管，残渣再加人15mL乙睛，旋涡振荡提取1min，4000r/min离心5min，上清液合并至50mL比色管，乙晴定容至50.0mL.摇匀后移取10.0mL乙腾提取液，以2×5mL正涡振荡30s，待净化. 已烷（4.3）振摇脱脂，使用氮气浓缩仪（5.7）在35C下氮吹至近干，加人3mL乙酸铵缓冲液（4.10），旋
7.2净化
将7.1所得的溶液以约1mL/min的流速全部通过强阳离子交换柱（4.14），抽干，先后以1.5mL甲醇、3mL氨水甲醇（4.8）洗脱，合并洗脱液，35C下氮吹至近干，以甲酸溶液（4.9）乙睛（4.1） （91）定容至1mL，过0.22μm滤膜（4.15），供液相色谱-串联质谱分析.
7.3空白基质溶液的制备
称取阴性样品5g（精确至0.01g），按7.1和7.2操作.
7.4测定
7.4.1液相色谱条件
a） b) 色谱柱：C，5pm，150mmX2.1mm或相当者； 柱温：30C；c） 流速：200 gL/min:d) 进样量：20l:梯度洗脱，洗脱程序见表1.
表1液相色谱梯度洗脱程序
时间/min 流速/(gyL/min) 300 乙睛/（%） 甲醇/（%） 20 0.1%甲酸/（%） 784 00 0 300 5 20 758 00 300 10 20 7010 00 300 40 20 4015 00 300 40 20 4015 50 300 2 20 7822 00 300 2 20 78
7.4.2质谱条件
a) 离子源：电喷雾源ES1： 扫描方式：多反应监测（MRM），正离子模式：b) c) 离子源温度：490C：雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体，使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求；[）定性离子对、定量离子对、去额电压和碰撞气能量见表2. e) 喷雾电压、去簇电压、碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度：
表2十五种喹诺酮类药物的质谱参数
药物名称 英文名称 定性离子对 定量离子对 硅撞气能量/V 硬撞池出口电压/V(n/) (m/≥)氟罗沙星 fleroxacin 370 4/326 4 370 4/269. 4 370. 4/326 4 30 40 70 70ofloxacin 362. 4/318. 4 30 60氧氟沙星 362 4/261 3 362 4/318 4 40 60依诺沙星 enoxacin 321. 1/303. 4 321 1/303 4 35 70321. 1/232. 2 320 4/276 6 26 48 70 50诺氟沙星 norfloxacin 320 4/233 2 320 4/276 6 30 50环丙沙星 ciprofloxacin 332 4/288 3 332 4/288 3 25 60332 4/245 3 33 60恩诺沙星 enrofloxacini 360 6/316 4 360 6/245.4 “9/9°09 40 60 60洛美沙星 lomefloxacin 28 60352. 3/265 4 33 60
