中华人民共和国国家标准
GB/T 20752-2006
猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中 硝基呋喃类代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
Method for the determination residues of themetabolites of nitrofuranin pork，beef，chicken，porcine liver and aquatic products-LC-MS-MSmethod
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布
前言
本标准的附录A和附录B为资料性附录.本标准由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出. 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口.本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局本标准主要起草人：庞国芳、张进杰、曹彦忠、郭彤彤、曹亚平、范春林、李学民、刘永明.本标准系首次发布的国家标准.
猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中 硝基呋喃类代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品（鱼类、虾蟹类和贝类）中呋哺它酮（furaltadone）的代谢物5-吗啉甲基-3-氨基-2-嗯唑烷基酮（3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinone，缩写为AMOZ）、映哺西林（nitrofurazone）的代谢物氨基脲（semicarbazide，缩写为 SEM）、呋确妥因（nitro- furantoin)的代谢物 1-氨基-2-内酰脲（1-aminohydantoin，缩写为AHD）和呋确唑酮（furazolidone）的代谢物3-氨基-2-唔唑烷基酮（3-amino-2-oxazolidinone，缩写为AOZ）残留量液相色谱-串联质谱测定方法.
本标准适用于猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品（鱼类、虾釜类和贝类）中5-吗甲基-3-氨基-2-唑烷基酮、氨基脲、1-氨基-2-内酰脲、3-氨基-2-唑烷基酮残留量的测定.
本标准方法的检出限：5-吗啉甲基-3-氨基-2-咳唑烷基酮、氨基脲、1-氨基-2-内酰脲、3-氨基-2-咳唑烷基酮的检出限均为0.5pg/kg.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T 6379. 1-2004 ISO 5725-1;1994 IDT)
性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，1SO5725-2：1994，IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T 6682-1992，negISO3696：1987)
试样中残留的硝基映响类代谢物在酸性条件下用2-硝基苯甲醛衍生化，用OasisHLB或性能相当的固相萃取柱净化.电喷雾离子化，液相色谱-串联质谱检测.用外标法或同位素标记的内标法定量.
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为优级纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1甲醇：色谱纯.4.2乙晴：色谱纯.4.3乙酸乙酯：色谱纯.4.4磷酸氢二钾，KHPO4.6二甲亚矾. 4.5乙酸.4.7盐酸.
4.8氢氧化钠4.92-硝基苯甲醛（2-NBA）.CH;NO：含量>99%.4.10磷酸氢二钾溶液：0.1mol/1.称取17.4g磷酸氢二钾（4.4），用水溶解，定容至1000mL. 4.11盐酸落液：0.2mol/L.量取17mL浓盐酸（4.7）用水定容至1000ml.4.12氢氧化钠溶液：1mol/L.称取40g氢氧化钠（4.8），用水溶解，定容至1000ml.4.13衍生剂：含2-硝基苯甲醛0.05mol/L.称取0.075g2-硝基苯甲醛（4.9）溶于10mL二甲亚矾（4.6），现用现配.4.15四种硝基呋哺代谢物标准物质：映喃它酮的代谢物5-吗啉甲基-3-氨基-2-咳唑烷基酮（3-amino-5- 4.14样品定容溶液：10mL乙晴（4.2)，0.3mL乙酸（4.5），用水稀释到100mL，morpholinomethyl-2-oxazolidinone，缩写为AMOZ）呋哺西林的代谢物氨基脲（semicarbazide，缩写为SEM)、呋响妥因的代谢物1-氨基-2-内酰脲（1-aminohydantoin，缩写为AHD）和映确唑酮的代谢物3-氨基-2-吨唑烷基酮（3-amino-2-oxazolidinone，缩写为AOZ）标准物质，四种标准物质的纯度均4.16四种硝基呋喃代谢物内标标准物质：5-吗啉甲基-3-氨基-2-呕唑烷基酮的内标物，D-AMOZ；氨 >99%.基豚的内标物，CN-SEM；1-氨基-2-内酰腺的内标物，C-AHD；3-氨基-2-咳唑烷基酮的内标物，D-AOZ.四种内标标准物质的纯度均≥99%.4.17四种硝基映响代谢物标准储备溶液：1.0mg/mL.称取适量的四种硝基映确代谢物标准物质 （4.15），分别用甲醇（4.1）稀释成1.0mg/mL的标准储备液.避光保存于一18C冰柜中，可使用六个月.4.18四种硝基呋哺代谢物混合标准溶液：0.1pg/mL.吸取适量四种硝基呋哺代谢物的标准储备溶液（4.17），用甲醇稀释成0.1pg/mL的混合标准溶液，避光保存于-18C冰柜中，可使用三个月.4.19四种硝基呋哺代谢物内标标准储备溶液：1.0mg/mL.称取适量的四种硝基呋响代谢物内标标 准物质（4.16），分别用甲醇配成1.0mg/mL的标准储备液.避光保存于一18C冰柜中，可使用六个月.4.20四种硝基呋哺代谢物内标标准溶液：0.1μg/mL.移取适量的四种硝基映响代谢物内标标准储备溶液（4.19），用甲醇稀释成0.1μg/mL的混合内标标准溶液，避光保存于-18C冰柜中，可使用三个月. 4.21Oasis HLB固相萃取柱或相当者：60mg，3mL.使用前分别用5mL甲醇和10mL水预处理，保持柱体湿润.4.220.2m滤膜.
5仪器
5.1液相色谱-串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源.5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g各一台.5.3液体混匀器.5.4固相萃取装置.5.5氮气吹干仪. 5.6恒温振荡水浴.5.7真空泵：真空度应达到80kPa.5.8微量注射器：25μL，100 juL.5.9棕色具塞离心管：25mL，50ml.5.11液器：50mL. 5.10pH计：测量精度士0.02pH单位.5.12离心机：转速4000r/min以上.2
6试样的制备与保存
6.1试样的制备
实验室样品用组织搞碎机绞碎，分出0.5kg作为试样.
6.2试样保存
试样置于-18C冰柜，避光保存.
7测定步骤
7.1混合基质标准校准溶液的制备
7.1.1样品称取和脱脂
称取5个阴性样品2g（精确到0.01g），分别置于50mL棕色离心管（5.9）中，加人10mL甲醇-水混合溶液（21），均质1min，再用5mL甲醇-水混合溶液洗涤均质器刀头，二者合并4000r/min离心5min，吸取上清液弃掉.向5个离心管中分别加人适量四种硝基映喃代谢物混合标准溶液（4.18），使四种硝基映哺代谢物最终测定浓度分别为0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、4.0ng/mL、 10.0ng/ml.再向每个离心管中加入适量混合内标标准溶液（4.20），使四种硝基呋哺代谢物内标物最终测定浓度均为2.0ng/ml.
7.1.2水解和衍生化
向上述每个离心管中加人10mL0.2mol/L盐酸溶液（4.11）均质1min，用10mL0.2mol/L盐酸溶液洗涤均质器刀头，二者合并后加人0.3mL衍生剂（4.13），用液体混匀器混匀，置于37C恒温振荡水浴（5.6）中避光反应16h.
7.1.3净化
上述衍生溶液放置至室温后，加人5mL0.1mol/L磷酸氢二钾溶液（4.10），用1mol/L氢氧化钠溶液（4.12）调节溶液pH约为7.4，4000r/min离心10min，上清液（若待测样品含脂肪较多，上清液加5mL正己烷，振荡2min，4 000r/min离心10min吸取并弃掉正已烷）倒入下接OasisHLB固相萃取柱（4.21）的贮液器（5.11）中，在固相萃取装置（5 4）上使样液以小于2mL/min的流速通过OasisHLB 柱，待样液全部通过固相萃取柱后用10mL水洗涤固相萃取柱，弃去全部流出液.用真空泵（5.7）在65kPa负压下抽干OasisHLB固相萃取柱15min.用5mL乙酸乙酯（4.3）洗脱被测物于25mL棕色离心管中，使用氮气吹干仪（5.5），在40C水浴中吹干，用样品定容溶液（4.14）溶解井定容至1.0ml，混匀后过0.2um滤膜（4.22）用液相色谱-串联质谱测定.
7.2待测样品溶液的制备
称取待测样品2g（精确到0.01g），置于50mL棕色具塞离心管（5.9）中，加入10mL甲醇-水混合溶液（21)，均质1min，再用5mL甲醇-水混合溶液洗涤均质器刀头，二者合并4000r/min离心5min，吸取上清液弃掉.向离心管中加入适量混合内标标准溶液，使四种硝基映响代谢物内标物最终测定浓度均为2.0ng/mL.按7.1.2和7.1.3操作.
7.3阴性样品基质空白溶液的制备
称取阴性样品2g（精确到0.01g），置于50mL棕色具塞离心管（5.9）中，加人10mL甲醇-水混合溶液（21)，均质1min，再用5mL甲醇-水混合溶液洗涤均质器刀头，二者合并4000r/min离心5 min，吸取上清液弃掉.按7.1.2和7.1.3操作.
7.4测定
7.4.1液相色谱条件
a）色谱柱：Atlantis-C，3.5μm，150mm×2.1mm（内径）或相当者；b）柱温：35C；
